低溫沼氣發酵高效菌系的篩選及微生物群落解析

杜 洋， 曹廣麗， 張軍政， 宋金柱， 叢 華 ， 張 達

(1．東北農業大學 生命科學學院， 黑龍江 哈爾濱 150030； 2. 哈爾濱工業大學 生命科學與技術學院， 黑龍江 哈爾濱 150001； 3哈爾濱工業大學 化工學院， 黑龍江 哈爾濱 150001)

低溫沼氣發酵高效菌系的篩選及微生物群落解析

杜 洋1， 曹廣麗2， 張軍政3， 宋金柱2， 叢 華2， 張 達1

(1．東北農業大學 生命科學學院， 黑龍江 哈爾濱 150030； 2. 哈爾濱工業大學 生命科學與技術學院， 黑龍江 哈爾濱 150001； 3哈爾濱工業大學 化工學院， 黑龍江 哈爾濱 150001)

為提高低溫下沼氣發酵效果，該研究使用不同接種物進行沼氣發酵，并利用MiSeq高通量測序技術對優良接種物發酵沼液的群落結構進行分析。結果顯示，以牛糞作為接種物在日產氣量、產氣速率和甲烷含量方面均優于其他組。高通量測序結果分析表明接種牛糞接種物后在細菌群落上形成的優勢類群為Bacteroidetes，Firmicutes，Proteobacteria和Spirochaetae，并以Firmicutes和Bacteroidetes占主要優勢地位；在古菌群落結構上形成的優勢菌群在目的分類水平主要為Methanosarcinales、Miscellaneous Crenarchaeotic Group(MCG)和Methanomicrobiales，并以Methanomicrobiales為主，在屬的分類水平上主要為Methanosaeta，MCG和Methanosarcina，其中Methanosaeta占主要地位。該研究為低溫沼氣發酵接種物的篩選和相關菌系分離及利用提供了科學依據。

沼氣； 牛糞； 高通量測序； 微生物群落結構； 產甲烷古菌

化石燃料儲備的耗竭和持續的環境污染，已成為當今世界面臨的主要問題。隨著人口增長和經濟發展，未來全球能源需求將繼續上升。能源和環境雙重危機促使世界各國積極尋找可再生的、環境友好型的化石燃料替代物—生物質能源[1-2]。沼氣作為一種可再生的清潔生物質能源，有著廣闊的發展前景，目前已得到全世界廣泛的關注和應用。但在沼氣發酵過程中仍存在一些普遍性問題，如發酵周期長、產氣量小、發酵體系不穩定等，而低溫下進行的沼氣發酵，這些問題則更加突出[3-6]。沼氣發酵是一個非常復雜的厭氧消化過程，涉及物料分解，酸化和產甲烷等階段，是多種微生物協同作用的結果。因此，探索適宜在低溫條件下發酵產沼氣的微生物，對解決寒冷地區產氣量低的問題尤為重要[7-9]。

本研究通過使用不同環境接種物進行沼氣發酵，篩選耐低溫且發酵性能優良的微生物菌系，并采用高通量測序技術解析篩選出的優良菌系中與低溫沼氣發酵產氣性能相關的微生物群落結構組成，以期為后期運行工藝的優化、相關菌系的分離和利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用污泥樣品分別采于自然生境的黑龍江省扎龍自然保護區和群力濕地；沼液取自長期運行的沼氣發酵罐；牛糞采于哈爾濱阿城區養殖場，與水等比例混合后置于實驗室備用。

1.2 方法

1.2.1 低溫沼氣發酵接種物的篩選

試驗所用發酵裝置為1 L反應器，上口接兩個玻璃管，一個連接排水集氣裝置，一個深入瓶底取樣。發酵物料為牛糞秸稈(總固體含量為12%，碳氮比為30∶1)常溫發酵20 d的酸化液，將pH值調節到7左右后使用。接種物分別為群力濕地污泥、扎龍濕地污泥、沼液與牛糞，發酵體系為600 mL，接種量為20%。將發酵裝置整體置于恒溫培養箱中，溫度維持在20℃下進行發酵，發酵周期為30天。使用排水集氣法收集氣體，利用氣相色譜儀測定氣體甲烷含量及發酵液樣品揮發性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)含量。

1.2.2 樣品總DNA提取

取接種牛糞組發酵前后的發酵沼液，使用CTAB法[10]提取微生物基因組DNA，之后利用1%瓊脂糖凝膠驗證。

1.2.3 PCR擴增細菌、古細菌16S RNA基因及高通量測序

細菌16s RNA基因擴增使用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[11]，以接種牛糞發酵反應液中的總DNA 為模板進行PCR 擴增，反應條件為95℃ 3 min, 95℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 45 s, 共27 個循環；72℃ 10 min。古細菌使用通用引物Arch344F(5′-ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA-3′)和Arch915R(5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3′)[12]進行擴增。反應條件為95℃ 3 min, 95℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 45 s, 共32個循環；72℃ 10 min。同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測后切膠回收。產物使用Miseq PE300測序，由上海美吉生物醫藥科技有限公司協助完成。

采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析并在各個水平統計每個樣品的群落組成[13]。OTU分布統計使用Usearch(vsesion 7.1 http://drive5.com/uparse/)。稀釋性曲線(Rarefaction curve)，多樣性指數(Alpha-diversity)，Shannon-Wiener曲線應用mothur version v.1.30.1指數分析[14]。

2 結果與分析

2.1 低溫沼氣發酵高效菌系的篩選

2.1.1 日產氣量的比較

在20℃條件下接種不同接種物，考察其對沼氣發酵影響。其中沼氣產量的高低可直接反映出沼氣發酵的效果。由圖1可見各組日產氣量變化呈現先上升后下降的趨勢，其中牛糞組日產氣量明顯高于其他組，峰值出現在13 d，最大日產氣量為310 mL，其他組均有產氣，但日產氣量均低于170 mL，由此可見，產氣量受接種物的影響很大。

圖1 不同接種物日產氣量的變化

2.1.2 產氣率的比較

由圖2可見，使用不同接種物條件下，沼氣發酵的速率由有明顯差異。扎龍污泥組產氣速率最低，僅為0.02 m3·m-3d-1，群力污泥組與沼液組產氣速率在0.035 m3·m-3d-1左右，牛糞組產氣速率最大，為0.11 m3·m-3d-1，是其他組的兩倍以上。據統計，沼氣的產氣速率在0.05 m3·m-3d-1以上時即可滿足日常烹飪的要求?？梢娫?0℃下，牛糞作為接種物的沼氣發酵可滿足農戶的基本生活需求。

圖2 不同接種物產氣速率的比較

2.1.3 甲烷含量的比較

沼氣是一種多組分的混合氣體，主要成分是甲烷[15-17]。試驗中甲烷含量與日產氣量變化趨勢一致，各組甲烷含量均為先升高后下降(見圖3)。結合日產氣量變化情況，這可能是由于在發酵初期，整個反應處于啟動階段，接種物中的產甲烷微生物仍處在適應環境的過程中，故產氣量和甲烷含量均較低。隨著發酵的進行，發酵體系中產甲烷微生物迅速生長并產生大量氣體，使得產甲烷量大幅度提高，甲烷含量也隨之升高。隨著底物的消耗及代謝產物的積累，產甲烷微生物的數量與活性下降，導致產甲烷能力下降，產生的甲烷量逐漸減少，甲烷含量也隨之下降?？傊?，相比于其他組，牛糞組甲烷含量最高，在發酵第13天出現峰值(40.8%)，而其他組含量較低，均低于3%。

圖3 不同接種物甲烷含量的變化

2.1.4 發酵液中VFA含量的變化

產甲烷菌只能利用甲酸、乙酸等簡單碳水化合物，故本試驗通過測定VFA變化以探究微生物的發酵過程。由于使用牛糞秸稈發酵酸化液作為底物，所以在發酵開始時就有一定量的VFA積累(見圖4)。由圖4可見，在起始發酵的前5天，各組的VFA仍呈上升趨勢，表明發酵初期接種物中產酸菌活躍，VFA含量的增加。之后VFA含量迅速下降，說明以VFA為底物的產甲烷菌數量及活性升高，迅速消耗積累的VFA，導致VFA含量下降。相比于其他接種物組，以牛糞作為接種物組VFA的下降速度最快，VFA消耗量最大。

圖4 不同接種物VFA含量的變化

2.2 細菌群落多樣性分析

對接種牛糞組的樣品進行菌群結構分析，其中N1為發酵初始樣品，N4為發酵終止樣品。

2.2.1 細菌多樣性評價

OTU(Operational Taxonomic Units)是在系統發育學或群體遺傳學研究中為了便于進行分析，人為給某一個分類單元(品系，屬，種等)設置的同一標志，通常在97%的相似水平下的OTU進行生物信息統計分析。chao是用chao1算法估計樣品中所含OTU數目的指數，在生態學中常用來估計物種總數。Coverage是指各樣本文庫的覆蓋率，其數值越高，則樣本中序列被測出的概率越高，該指數反映本次測序結果是否代表了樣本中微生物的真實情況。

利用mothur軟件對樣品N1 和N4的測序結果進行序列比對，在此基礎上對兩個樣品的OTU進行多樣性分析。從表1中可以看出，在序列相似度為97%時，所取樣品N1和N4分別產生533和551個OTU。所有chao指數均大于OTU數目，覆蓋率在99%以上，說明OTU相似度的選取比較合理，且繼續增加測序量對繼續發現新的OTU影響不大。

表1 發酵樣品中細菌多樣性指數統計

2.2.2 細菌群落組成的系統發育分析

筆者研究從初始發酵樣品N1和終止發酵樣品N4中分別獲得18802和25095條高質量有效的微生物序列，根據序列相似度97%時的聚類分析，產生500左右OTU，相比傳統常用微生物研究的分子生物學手段、DGGE和克隆文庫技術體現出巨大優勢。

圖5 細菌在門分類水平上的微生物組成

如圖5所示，發酵前后的細菌多樣性十分豐富，在門的分類水平上共有9個類群，分別為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、螺旋體門(Spirochaete)、變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、互養菌門(Synergistetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)和纖維桿菌門(Fibrobacteres)。整體而言，在細菌結構群落變化過程中，發酵體系中出現了以Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria和Spirochaetae為優勢類群的水解酸化體系，約占整個細菌微生物系統的85%以上。通過對系統發酵前后的比較發現，在發酵后Chloroflexi門微生物受到明顯抑制，由原來的7.21%下降至后期的2.15%，Proteobacteria前后變化不大，Spirochaete略有升高，而 Firmicutes和Bacteroidetes在發酵前后穩定在60%左右，始終占據著優勢地位。

2.3 古細菌群落多樣性分析

2.3.1 古細菌多樣性評價

表2中可以看出，在序列相似度為97%時，N1和N4分別產生39與42個OTU，所有chao指數均大于或等于OTU數目，覆蓋率在99%以上，說明OTU相似度的選取比較合理，且繼續增加測序量對繼續發現新種的影響不大。

表2 發酵樣品中古菌多樣性指數統計

2.3.2 古細菌群落組成的系統發育分析

如圖6(A)所示在門的分類水平上主要為兩個類群：廣古菌門(Euryarchaeota)和奇古菌門(Thaumarchaeota)。此兩類群微生物在N1中分別為66.16%和33.79%，N4中分別為75.40%和24.56%。在發酵后，廣古菌門微生物略有增加，而奇古菌門微生物所占比例略有下降。如圖7所示在目的分類水平上主要為5個類群：甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)、Miscellaneous Crenarchaeotic Group(MCG)，

圖6 古細菌在門分類水平上的分布

圖7 古細菌在目分類水平上的分布

甲烷微菌目(Methanomicrobiales)、甲烷桿菌目(Methanobacteriales)和熱原體目(Thermoplasmatales)，其中甲烷八疊球菌目占主要地位，其在發酵前后分別占總體的56.05%和62.69%。

在屬的分類水平上主要為甲烷鬃菌屬(Methanosaeta)，MCG和甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)，其在N1中的比例分別為52.13%，33.79%和3.92%，N4中比例分別為44.36%，24.56%和18.34%(見表3)。

表3 發酵樣品相對豐度高于2%的古細菌組成

注：分類學數據庫中會出現一些分類學譜系中的中間等級沒有科學名稱，以norank作為標記。

3 討論

沼氣發酵過程是一個由多種微生物協同，交替作用的復雜生化過程。微生物的種類及組成是決定沼氣發酵性能的重要決定因素之一。本研究選用不同環境來源的微生物菌源作為接種物，采用沼氣模擬發酵與高通量測序技術相結合的方法，進行了低溫優良菌系的篩選及微生物群落結構解析。通過日產氣量、產氣率、甲烷含量及發酵過程中揮發酸的測定，對不同接種物的沼氣發酵性能進行了分析，牛糞組的發酵效果最佳，其日產氣量、產氣速率、甲烷含量等均高于其他組，產氣速率達到了0.11 m3·m-3d-1?？拙S濤[18]等人在不同接種源的低溫沼氣發酵試驗中發現，16℃下最優接種物的產氣速率約為0.05 m3·m-3d-1。丁福貴[19]等對污泥的低溫馴化過程中發現，15℃下的產氣速率最大值為0.105 m3·m-3d-1。裴占江[20]等采用牛糞和稻稈混合作為原料，20℃下最佳TS的產氣速率為0.09 m3·m-3d-1左右?？梢?，本研究中以牛糞作為接種具有較高的產氣速率。

為了探明牛糞作為接種物的沼氣發酵過程中功能微生物的群落結構特征，應用高通量測序技術解析了牛糞組發酵前后的細菌與古菌的菌群結構。分析表明細菌在門分類水平上的主要菌群為Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria和Spirochaetae，占序列總數的85%以上，其中Proteobacteria發酵前后變化不大，Firmicutes和Bacteroidetes則一直處于主要優勢菌的地位。據報道Firmicutes微生物在降解纖維素、蛋白質等大分子物質中起到關鍵作用[21]，Bacteroidetes微生物可將糖類分解成乙酸[22]。由此表明，這兩個門類微生物的活躍保證了發酵水解酸化階段的正常啟動與運行，同時為產甲烷階段提供了可利用的底物，保證了沼氣發酵的持續進行。古菌在目的水平主要優勢類群為Methanosarcinales，Miscellaneous Crenarchaeotic Group和Methanomicrobiales，并以Methanosarcinales占主要地位。其在的屬的分類水平上主要為Methanosaeta，MCG和Methanosarcina。其中發酵前后相對豐度最高的是Methanosaeta，發酵前(52.13%)與發酵后(44.36%)所占豐度均最大，而相對豐度增長最大的是Methanosarcina，對比發酵前后其相對豐度增加5倍以上(由發酵前3.92%增加到發酵后18.34%)。Methanosaeta與Methanosarcina是以低碳酸代謝為主的產甲烷菌屬[23]，在已報到的文獻中也推測Methanosaeta與Methanosarcina微生物是低溫條件下產甲烷過程的主要功能菌群[18,24]，結合試驗中VFA水平的下降，筆者研究進一步證明了Methanosaeta與Methanosarcina是低溫環境下維持沼氣發酵系統正常產氣的關鍵菌屬。

綜上所述，接種物的篩選在沼氣發酵中具有重要的作用，優良的接種物可以很大程度上提高沼氣發酵的效果。同時也說明，調控微生物種群結構形成活性較強的水解酸化和產甲烷菌類群是提高系統運行效率的關鍵。由于沼氣發酵過程涉及的微生物眾多，其中有大量未培養的微生物，而高通量測序技術可以使我們更好的了解發酵的菌群及其變化情況。本研究為進一步優化低溫沼氣發酵條件和功能菌系的分離及利用奠定了基礎。

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Screening of High Efficient Inoculum for Low Temperature Biogas Fermentation And Its Microbial Community Analysis /

DU Yang1, CAO Guang-li2, ZHANG Jun-zheng3, SONG Jin-zhu2, CONG Hua2, ZHANG Da1/

(1.College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2.School of Life Science and Technology, Harbin Institute of Technology, Harbin 150001, China, 3.School of Chemical Engineering and Technology, Harbin Institute of Technology, Harbin 150001, China)

In order to improve the efficiency of biogas fermentation at low temperature, the effects of several kinds of inoculums were compared, the better one was selected, and its microbial community was analyzed by the method of MiSeq high-throughput sequencing. The results showed that cow dung was the better inoculum comparing with other inoculums, for it obtained higher biogas production. High-throughput sequencing analysis demonstrated that the main bacterial wereBacteroidetes,Firmicutes,ProteobacteriaandSpirochaetaein cow dung inoculum, and the dominant wereFirmicutesandBacteroidetes. The main archaea wereMethanosarcinales,MiscellaneousCrenarchaeoticgroup(MCG), andMethanomicrobialesat order level classification and theMethanosarcinaleswas the dominant. At the genus level classification, the main archaea wereMethanosaeta,MCGandMethanosarcinawithMethanosaetaas dominant.

biogas; cow manure; high throughput sequencing; microbial community structure; methanogenic archaea

2016-03-02

2016-05-02

項目來源： 國家科技支撐計劃(2014BAJ21B02-04)

杜 洋(1990-)，男，主要從事植物生物質生物轉化研究等工作，E-mail: duy126@126.com

張 達，E-mail: zhangda2011@126.com

S216.4； X713

A

1000-1166(2017)02-0009-06