雞胚成纖維細胞T7噬菌體文庫的構建

殷玉瑾+張巫凡+張聰+王臣

摘 要：本試驗旨在構建雞胚成纖維細胞T7噬菌體文庫。通過分子生物學方法，將雞胚成纖維細胞cDNA片段連接于T7SeLect 10-1載體上，然后進行體外包裝、原始文庫的測定、擴增及滴度的測定、序列測定。實驗結果顯示，所構建的雞胚成纖維細胞T7噬菌體原始文庫的滴度為1.1×106pfu/mL，重組效率為60%，擴增后的雞胚成纖維細胞T7噬菌體文庫的滴度為1.8×1010 pfu/mL，雞胚成纖維細胞T7噬菌體文庫測序后經同源性比對，有9個噬菌斑的測序結果與雞全基因同源，1個為空載體。本實驗初步構建了雞胚成纖維細胞T7噬菌體文庫，為進一步研究雞胚成纖維細胞蛋白相互作用提供了實驗研究平臺。

關鍵字：雞胚成纖維細胞；T7噬菌體；噬菌體文庫；蛋白質相互作用

雞胚成纖維細胞（CEF）是一種常用的原代培養細胞， 在實驗中常作宿主細胞，用于體外培養許多病毒。雞胚成纖維細胞（CEF）存在病毒受體，因此能夠增殖病毒。雞胚成纖維細胞的原代培養在分子生物學，細胞學，遺傳學，免疫學，病毒學，腫瘤學，及細胞工程學等領域，發展成為一門重要的生物技術，并取得顯著成就。T7噬菌體是裂解性噬菌體，在細胞質中完成組裝后，成熟的噬菌體直接通過細胞裂解而釋放。不像絲狀噬菌體系統，展示在T7表面的多肽或蛋白質不需要通過細胞膜分泌出來，因而其表面展示多肽和蛋白的范圍廣。另外，T7噬菌體生長迅速、復制速度快、克隆效率高以及穩定的特性，使之成為替代其他傳統系統的更好選擇。為此，我們擬構建雞胚成纖維細胞T7噬菌體表達文庫，以期從中篩選出不同病毒的相關受體，為進一步研究雞胚成纖維細胞蛋白相互作用提供了實驗研究平臺。

一、材料與方法

1.試驗材料

T7Select10-1b? Cloning Kit （Novagen公司），雞胚成纖維細胞cDNA：由本實驗室制備和保存。

2.雞胚成纖維細胞cDNA與T7受體臂的連接

在無菌的1.5mL管中混合cDNA片段與T7受體臂，然后輕輕地用移液器槍頭上下吹打混勻，于16℃孵育12～16h。貯存于4℃，備用。

3.雞胚成纖維細胞T7噬菌體文庫的體外包裝

向以解凍的25?L T7選擇性包裝提取物中加入5?L連接反應產物，室溫孵育2h后，再加入270?L無菌LB液體培養基，終止反應。

4.雞胚成纖維細胞T7噬菌體原始文庫的測定

雞胚成纖維細胞T7噬菌體原始文庫進行測定，然后隨機挑選10個陽性克隆，用 T7seleet UP/DOWN引物進行PCR檢測其重組率。最后進行瓊脂糖凝膠電泳。

5.雞胚成纖維細胞T7噬菌體文庫的擴增及滴度的測定

本實驗選用平板法對文庫進行擴增。首先將過夜培養的宿主菌按2%的接種量接種50 mL LB液體培養基中，37℃振蕩培養至OD600=0.6～1.0，貯存于4℃，備用。最后通過噬菌斑測定擴增后文庫的滴度（同原始文庫滴度測定）。

6.雞胚成纖維細胞T7噬菌體文庫的序列測定

取上述隨機挑選的10個陽性克隆噬菌斑PCR產物，送至上海生物工程技術服務有限公司測序。測序結果NCBI進行比對，鑒定其與雞基因全序列的同源性。

二、結果與分析

1.雞胚成纖維細胞cDNA T7噬菌體原始文庫的滴度

雞胚成纖維細胞體噬菌體原始文庫在倍比稀釋度為10-3時的噬菌斑個數約100（圖1），在稀釋度為10-4時的噬菌斑個數為11（圖2），代入公式：稀釋倍數×10×板上噬菌斑的數量，計算得雞胚成纖維細胞T7 噬菌體原始文庫的滴度為1.1×106pfu/ mL。

2.雞胚成纖維細胞T7噬菌體文庫的重組子鑒定

隨機挑選10個噬菌斑，用 T7seleetUP/DOWN引物進行PCR檢測重組子比例，重組子為6個，占60%，即雞胚成纖維細胞cDNA文庫重組率為60%。

3.雞胚成纖維細胞T7噬菌體文庫擴增后的滴度

擴增后的雞胚成纖維細胞T7噬菌體文庫稀釋度為10-7時的噬菌斑個數約為200，在稀釋度為10-8時的噬菌斑個數為18，經計算得擴增后的雞胚成纖維細胞T7噬菌體文庫滴度為1.8 ×1010 pfu/mL。

三、討論

雞胚成纖維細胞是雞胚成纖維細胞（ CEF） 是一種常用的原代培養細胞， 是許多病毒體外培養的宿主細胞， 是研究細胞相互作用的重要模型。噬菌體展示技術是近年建立和發展起來的利用噬菌體表達外源基因的一項新技術，它實現了基因型和表型的結合，提供了高效率的篩選系統。通過噬菌體展示技術的生物淘選過程， 篩選與靶標高度親和的蛋白質序列， 從而有助于研究分子間的相互識別、相互作用的分子機制。本研究初步構建的CEF cDNA的T7 噬菌體表達文庫，為今后利用文庫篩選不同病毒在CEF上的細胞受體和研究其功能提供了材料來源，也為研究CEF 的基因及功能，以及病毒與CEF 的相互作用奠定了基礎。

參考文獻：

[1]劉永清，孫浩. 雞胚成纖維細胞原代培養與純化的初探[J].豬與禽，2008 ，2（1）：72-73.

[2]冀霞，趙瑞君，劉美德，等. 白紋伊蟻T7噬菌體展示cDNA文庫的構建[J].寄生蟲與醫學昆蟲學報，2012，19（2）：78-82.

作者簡介：殷玉瑾（1995-），女，河南周口人，本科學歷。

王臣（1979-），男，安徽六安人，博士學歷，副教授，研究方向：動物分子病原學與研究學