肝癌組織HNF4α mRNA 定量檢測方法的建立與初步應用

張偉，董政，孔慧芳，張百龍，毛威，高旭東，榮義輝

·原發性肝癌·

肝癌組織HNF4α mRNA 定量檢測方法的建立與初步應用

張偉，董政，孔慧芳，張百龍，毛威，高旭東，榮義輝

目的建立一種定量檢測肝細胞癌（HCC）組織肝細胞核因子4α（HNF4α）mRNA的方法。方法取手術獲得的HCC組織16例，提取總RNA，逆轉錄PCR擴增獲得全長HNF4α mRNA對應cDNA產物，經TA克隆后，測序確認。根據獲得序列，設計檢測HNF4α mRNA引物及MGB熒光探針。以體外轉錄HNF4α mRNA為標準品，建立一步法逆轉錄熒光定量PCR檢測方法，同時設定β-actin mRNA為內參對照，最終計算得到組織HNF4α mRNA水平。采用免疫組化染色檢測HNF4α蛋白表達，比較HNF4α mRNA水平與HNF4α蛋白表達的對應結果。結果HCC組織HNF4α mRNA定量標準曲線斜率為-3.237，相關系數r值達0.994，β-actin mRNA定量標準曲線斜率為-3.037，相關系數r值為0.996，表明建立的方法可用于檢測HNF4α mRNA定量（V-4α值），16例HCC組織HNF4α mRNA與HNF4α蛋白表達結果呈一致性對應關系。結論我們初步成功建立了定量檢測HCC組織HNF4α mRNA水平方法，其意義還需要進一步研究。

肝細胞癌；肝細胞核因子4α；逆轉錄熒光定量PCR法

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是指發生于肝細胞的惡性腫瘤,是侵襲力最強的惡性腫瘤之一，在東南亞地區較為常見[1，2]，超過80%HCC患者同時伴有病毒性肝炎和肝硬化[1-3]。研究發現[4-9]，肝細胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α）是核激素受體超家族HNF4的成員之一，是一種保守性的配體依賴性轉錄因子，處于轉錄因子網絡調控的上游，可通過多種機制參與肝臟特異性基因的表達和調控，是肝細胞正常生理功能發揮和維持的關鍵調控因子之一[10-12]。HNF4α表達異常與各種肝臟疾病，如非酒精性脂肪肝、原發性肝癌、肝纖維化和病毒性肝炎等密切相關[13-17]。目前認為，HNF4α是HCC治療的潛在靶點，并可作為HCC患者治療后預測其預后的參考指標，HNF4α蛋白在肝組織中的表達強弱直接影響HCC患者預后。但到目前為止，采用免疫組化法檢測組織HNF4α表達，存在檢測時間長，結果易受讀片醫師主觀判斷的影響等缺點。我們建立了實時熒光定量PCR法檢測HCC組織HNF4α mRNA水平，確定其閾值，以判斷HCC組織HNF4α水平的高低作為臨床快速定量檢測的手段，以判定HCC組織的分化程度，為HCC患者的早期診斷和預后提供依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源2014年1月～2015年12月在解放軍第302醫院經手術切除并經病理學檢查確診為HCC組織16例，男性13例，女性3例；年齡30～78歲，平均年齡為51.17±10.9歲。標本保存于組織RNA保存液中，凍存于-80℃。

1.2 主要試劑和儀器組織RNA保存液、PCR產物純化試劑盒和組織RNA提取試劑盒（Qiagen，德國），DEPC（Sigma，美國），Ex TaqHS（TaKaRa，美國），RNase Inhibitor和T-A克隆試劑盒（Promega，美國），M-MLV逆轉錄酶（Fermentas，立陶宛），質粒提取試劑盒（上海生工，中國），DNA純化試劑盒（Qiagen，德國），體外RNA制備試劑盒（Promega，美國）。β-actin mRNA標準品【全國臨床實驗標準委員會（NCCLs），中國】，抗HNF4α單克隆抗體（Eptomics，美國），免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒（中杉金橋，中國），其它生化試劑均為國產分析純。臺式高速低溫離心機（Thermo，美國），實時熒光定量PCR儀（宏石，中國）。

1.3 引物探針設計與合成自NCBI獲得HNF4α cDNA序列（GenBanknumber：NM_000545），按照序列信息（表1）合成HNF4α擴增引物以及熒光定量探針。

1.4 肝組織HNF4α mRNA的提取及cDNA擴增取HCC手術患者獲得的新鮮腫瘤組織或液氮保存的冰凍HCC組織，立即加入液氮，在研缽內研碎。然后，嚴格按照Qiagen組織RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。按照逆轉錄試劑盒說明書以oligd T引物在42℃作用90 min，70℃15 min，滅活逆轉錄酶，將mRNA逆轉錄為cDNA。PCR擴增體系：2× PCR Mix 25μl，4αF 0.5μl，4αR 0.5μl，cDNA產物5μl，加ddH2O補足到50 μl；PCR擴增條件：94℃3 min；94℃15 s，55℃20 s，72℃40 s，35個循環；72℃10 min；4℃保持。將全部PCR產物加入至1%TAE瓊脂糖凝膠中，110 v，25 min，進行電泳鑒定，在約500 bp的位置出現陽性條帶，對樣本進行切膠，按照試劑盒說明回收目的PCR產物片段，以30 μl EB重溶產物DNA，置于-20℃保存。

表1 HNF4α mRNA和β-actin擴增引物及探針

1.5 全長HNF4αcDNA的克隆在1.5 ml EP管中，加T4 DNA連接酶Buffer 1μl，pGEM-T Easy載體（50ng）1μl，HNF4αcDNA膠回收產物3 μl，T4 DNA連接酶（3 U/μl）1μl，加ddH2O補足至10 μl，輕柔混勻后，短暫離心，置于4℃過夜。自-70℃冰箱中取出JM109感受態細胞，置于冰上5 min，待菌液完全融化后，輕柔吹打混合，取感受態細胞50 μl，將其加入到連接體系的EP管中，靜置于冰上20 min，在42℃水浴中熱擊1 min，確保轉化EP管不會震動。隨后，迅速將EP管移到冰浴中，讓細胞冷卻2 min。在每管連接反應的轉化細胞中加入平衡至室溫的SOC培養基500 μl。在轉化管恒溫振蕩器中振蕩培養，37℃，180 r/m搖菌1 h。按照每細菌培養板300 μl轉化培養基比例將培養基均勻涂布于含有X-Gal/IPTG/氨芐青霉素的固體平板培養皿表面。將培養皿置于37℃過夜。次日，挑取白色單克隆菌斑進行鑒定。取雙蒸水10 μl，加入PCR反應管中，采用無菌牙簽挑取白色單克隆菌落，置于水中沖涮，再在復制板膠上劃數下，將編好號的PCR管置于95℃金屬浴中10 min，隨后冰浴3 min，裂解細菌。將復制板置于37℃孵箱中過夜培養。以裂解菌液產物為模板，與前述1.4中PCR反應條件和體系相同，進行目的片段擴增。擴增產物經1%TAE瓊脂糖凝膠電泳鑒定，出現目的片段則為陽性克隆。取陽性克隆菌液送測序鑒定。

1.6 體外轉錄合成cRNA，制備標準品提取測序正確的HNF4α全長cDNA克隆質粒，按照前述1.4中引物擴增HNF4α全長基因，利用Qiagen公司的PCR產物純化試劑盒進行純化回收，之后將其作為模板，按照Promega公司體外RNA制備試劑盒進行體外轉錄。轉錄產物經無RNase的Dnase I消化，除去其中的DNA模板后，75℃10 min，將DNase I滅活，經RT-PCR驗證所合成的cRNA，測定其A260吸收值，并計算濃度為1.0×108copies/10 μl，保存于-70℃備用。

1.7 檢測HNF4α mRNA熒光定量RT-PCR反應條件的優化和標準曲線的建立以制備的cRNA為模板，對反應體系中的引物、MGB探針、dNTP、Mg2+濃度以及退火溫度進行優化篩選，選擇靈敏度高、背景信號低、擴增熒光信號曲線呈典型S型的反應條件作為最適反應條件。然后，用滅菌雙蒸水將純化的質粒標準品倍比稀釋至108、107、106、105、104、103、102copies/ml，采用最適條件進行PCR反應。在反應結束后，根據擴增曲線情況，設定和調整CT值的基線和閾值，通過收集的熒光曲線和CT值，計算機自動繪制標準曲線。

1.8 HCC組織HNF4α免疫組化檢測及其HNF4α mRNA閾值的確定免疫組化主要步驟：采用Maxvision法，將切片置于60℃烤箱1 h；脫蠟水化，即石蠟切片經二甲苯15 min，梯度酒精100%、100%、95%、90%、80%、70%各5 min；蒸餾水新配的3%H2O2室溫浸泡10 min，蒸餾水沖洗3次；將切片浸入0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（PH 6.0），在高壓鍋中加熱2 min，冷卻至室溫。PBS洗滌5 min×3次。滴加適當稀釋（1:150）的一抗，37℃放置1 h，PBS洗滌5 min×3次。滴加二抗（1:1000），37℃放置20 min，PBS洗滌5 min×3次。滴加新配DAB顯色劑，室溫下控制顯色時間（約5 min），蒸餾水終止顯色時間；蘇木素復染核，沖洗，1%鹽酸酒精分化，自來水沖洗。梯度酒精70%、80%、90%、95%、100%、100%脫水各5 min，二甲苯20 min，中性樹膠封片。至少2名病理學醫師在雙盲情況下對免疫組織化學檢測結果進行讀片，結果判定方法和參照標準具體如下：（1）染色強度（intensity）評分標準：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；（2）染色程度(extent)評分標準：在顯微鏡下隨機選取5個視野，根據每個視野中陽性細胞的比例進行評分，0%為0分，1%～10%為1分，11～50%為2分，51%～80%為3分，＞80%為4分；（3）免疫組化評價標準：染色強度得分與染色程度得分相乘，結果0～1分為0級，2～4分為1級，5～7分為2級，8～12分為3級；（4）表達水平判斷標準：0～1級定義為蛋白低表達，2～3級定義為蛋白高表達。同時提取HCC組織mRNA，用建立的方法檢測HNF4α mRNA和內參照β-actin，分別將HNF4α mRNA和β-actin mRNA定量水平取lg值后相比，得到肝組織HNF4α mRNA水平（V-4α）。V-4α=[lg（HNF4α mRNA定量水平）]/lg (β-actin mRNA定量水平)。將V-4α水平與免疫組化檢測結果0～3對應，從而得到V-4α的閾值。

2 結果

2.1 HNF4α基因cDNA擴增情況取HCC患者外科手術切除的癌旁組織2份（患者A和患者B），提取肝組織總RNA，經特異性引物擴增，獲得HNF4αcDNA 1.5 kb產物，其1%TAE鑒定見圖1。

圖1 HNF4a cDNA擴增產物電泳鑒定

2.2 HNF4α基因cDNA克隆情況取PCR產物鑒定條帶位置正確的樣本，經膠回收目的片段，藍白斑篩選（圖2A），挑取白色陽性克隆菌落行PCR鑒定（圖2B），將菌液送測序、鑒定，結果顯示藍白斑篩選斑點均勻清晰，患者A和患者B分別挑選4個菌斑進行菌落PCR，結果顯示克隆基因陽性且位置正確。

圖2 目的片段的克隆及鑒定

2.3 檢測HNF4α mRNA的熒光定量RT-PCR反應條件的建立及優化情況在PCR管中加入體外轉錄生成的cRNA 3 μl，作為標準品模板，經多次重復性實驗發現，該檢測方法最適反應總體積為50 μL，其中模板3 μL；最適的引物濃度為0.2 μmol/L，探針濃度為0.3 μmol/L，Mg2+濃度為3.0 mmol/L，Taq DNA為1.25U，M-MLV逆轉錄酶為300U，RNase Inhibitor為50 U。PCR反應最適循環參數為42℃5 min，94℃3 min；之后94℃15 s，56℃15 s，72℃30 s，3個預擴增循環；94℃15 s，60℃30 s，40個循環。

2.4 檢測HNF4α mRNA和β-actin mRNA標準曲線的建立經梯度稀釋的cRNA標準品在擴增后呈現典型的S型擴增曲線，對熒光信號分析顯示，在108、107、106、105、104、103、102copies/ml范圍內，7個點具有良好的線性關系，斜率為-3.237，相關系數r值達0.994，表明該標準品達到實驗要求。將2.5×108copies/ml的β-actin mRNA標準品經稀釋為108、106、105、103copies/ml，標準曲線斜率為-3.037，相關系數r值為0.996。以樣本的拷貝數對數（X）為橫坐標，檢測的循環數CT值為縱坐標建立標準曲線，結果見圖3，以用于HNF4α mRNA和β-actin mRNA的絕對定量。

圖3 檢測HNF4α mRNA和β-actin mRNA的熒光定量PCR擴增曲線和標準曲線

2.5 HCC組織HNF4α蛋白表達情況經免疫組化檢測，在16例HCC組織中，發現13例（81.3%）HNF4α蛋白表達陽性，其中0級3例（18.8%），1級6例（37.5%），2級5例（31.3%），3級2例（12.5%，圖4）。

圖4 HCC組織HNF4α蛋白表達情況（SP，400×）

2.6 HCC組織HNF4α mRNA水平與HNF4α蛋白表達強度的對應比較檢測16例HCC組織HNF4α mRNA和β-actin mRNA，按上述方法計算V-4α值。免疫組化檢測結果與V-4α值的對應結果為：0級對應V-4α≤0.15；1級對應0.15＜V-4α≤0.45；2級對應0.46＜V-4α≤0.77；3級對應V-4α＞0.77（表2），結果顯示HNF4α mRNA定量結果與HNF4α蛋白表達強度結果有一致性的對應關系，但HNF4α mRNA定量結果更快捷，人為主觀影響因素更小，為后續大樣本分析其對應關系，可能得到更精確的閾值，為臨床提供更可靠的診斷支持。

表2 HCC組織HNF4α mRNA水平與HNF4α蛋白表達強度比較

3 討論

積極尋找預測HCC發生、轉移或復發，判斷HCC患者預后的腫瘤標志物成為目前HCC研究的重點及熱點內容[18]。HNF4α作為一個新的HCC生物標志物，在HCC的診斷，判斷腫瘤轉移或復發、治療結果和預后等方面可能具有重要價值。HNF4α在正常肝組織中表達最高，高分化和中分化組織腫瘤HNF4α表達高于低分化肝細胞癌。鑒于HNF4α蛋白只在細胞內表達，臨床只能采用免疫組化檢測判斷HNF4α蛋白在HCC組織中的表達量。我們建立了檢測HCC組織HNF4α mRNA的定量方法，通過內參矯正后，可以反映HCC組織HNF4α的表達量。我們隨機挑選16例HCC患者檢測HNF4α mRNA水平，同時采用免疫組化法檢測了HNF4α蛋白表達，經比較兩者結果，得到了HNF4α mRNA水平閾值，即0級對應V-4α≤0.15，1級對應0.15＜V-4α≤0.45，2級對應0.46＜V-4α≤0.77，3級對應V-4α＞0.77。這樣可以快速判斷HCC組織的分化程度，從而獲得其生物學性質的判定。

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（收稿：2016-11-17）

（本文編輯：陳從新）

EstablishmentofRT-PCRforthedetectionofhepatocytenuclearfactor4αinhepatocellular carcinoma

Zhang Wei，Dong Zheng，Kong Huifang，et al.Research Center for Liver Cancer，302nd Hospital，Beijing，100039

ObjectiveTo establish a quantified reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）for the detection of hepatocyte nuclear factor 4α（HNF4α）mRNA in hepatocellular carcinoma tissues.Method Total RNA was extracted from 16 cancerous tissues of patients with hepatocellular carcinoma（HCC）.The fulllength cDNA was obtained by RT-PCR and the products was sequenced after TA cloning.Then，the primer and MGB fluorescent probe were designed for HNF4α mRNA quantification.A one-step RT quantitative PCR assay was established and β-actin mRNA acted as internal control.The HNF4aα mRNA levels in the tissues was calculated.The expression of HNF4α protein was also detected in cancerous tissues by immunohistochemical staining.ResultsThequantitativedetectionofHNF4αmRN（V-4α）inHCCtissueswasestablished successfully，and the slope of the standard curve was-3.237 with the correlation coefficient（r）being 0.994.The standard curve of β-actin mRNA was-3.037，and the correlation coefficient（r）was 0.996.The HNF4α mRNA levels were consistent with the HNF4α protein expression in the 16 HCC tissues.ConclusionWe successfully establish a quantitative PCR for the detection of HNF4α mRNA in HCC patients，which warrants further study.

Hepatocellularcarcinoma；Hepatocytenuclearfactor4α；Quantifiedreversetranscriptionpolymerase chain reaction

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.03.012

100039北京市解放軍第302醫院肝臟腫瘤診療與研究中心

張偉，男，35歲，碩士研究生，主治醫師。主要從事肝癌臨床診治研究。E-mail：yanjiu3369@126.com

榮義輝，E-mail：ryh3021977@hotmail.com