自身免疫性肝炎患者外周血CD8+T細胞PD-1表達水平變化

芮志蓮

自身免疫性肝炎患者外周血CD8+T細胞PD-1表達水平變化

芮志蓮

目的探討自身免疫性肝炎（AIH）患者外周血CD8+T細胞程序性死亡因子（PD-1）表達水平的變化。方法隨機選取我院收治的AIH患者25例和健康志愿者25例，使用流式細胞儀進行檢測外周血CD8+T淋巴細胞PD-1分子和PD-1分子受體（PD-L1）表達水平。結果與健康人比，AIH血CD8+T細胞PD-1/PD-L1表達陽性百分比分別為（2.6±0.1）%和（2.1±0.8）%，明顯高于健康人【（0.5±0.2）%和（0.4±0.1）%，P＜0.01）；10例男性AIH患者血CD8+T細胞PD-1/PD-L1表達陽性百分比分別為（1.4±0.5）%和（2.3±0.6）%，顯著低于15例女性患者【（3.8±0.8）%和（2.5±0.5）%），P＜0.05）；經皮質激素治療4 w，25例AIH患者獲得病情緩解。AIH患者在緩解期PD-1/PD-L1表達水平分別為（3.3±0.2）%和（2.8±0.3）%。結論AHI患者外周血CD8+T細胞PD-1表達水平升高，與疾病活動可能存在密切的關系。

自身免疫性肝炎；CD8+T細胞；程序性死亡因子-1；程序性死亡因子受體-1

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一種復雜的免疫損傷性疾病，其病因和發病機理至今尚不明確。有學者認為其發病與遺傳易感和病毒感染等多方面因素有關[1-3]。研究發現，人體存在一種調節T細胞分化和活化抑制傳導信號的共刺激分子，即程序性死亡因子（programmed death-l，PD-1）[4]。由于PD-1可以通過與其配體（programmed death ligand 1，PD-L1）的互相作用，使得效應性或記憶性T淋巴細胞功能和首次免疫應答水平降低，起到抑制免疫反應的作用[5]。病毒性疾病的進展過程與PD-1信號通路密切相關。PD-1還與糖尿病、系統性紅斑狼瘡等多種自身免疫性疾病的進展有關[6，7]。本研究檢測了AIH患者血CD8+T淋巴細胞PD-1表達水平，以探討PD-1在AIH發病過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料2013年1月～2015年12月我院收治的AIH患者25例，男10例，女15例；平均年齡為42.2±1.7歲。根據2010年美國肝病學會（AASLD）更新的有關AIH治療指南以及2008年國際自身免疫性肝炎小組（IAIHG）提出的AIH簡化診斷積分系統進行臨床診斷。其中8例患者經服用潑尼松龍后癥狀有所緩解，其余17例患者由于病情發展至晚期，故未行相應免疫抑制劑治療。排除遺傳代謝性、藥物性和酒精性肝病以及肝炎病毒感染患者。另選健康人25例，男10例，女15例；平均年齡為28.8±6.7歲。

1.2 外周血CD8+T淋巴細胞PD-1表達水平檢測抽取空腹外周靜脈血3 ml，經肝素抗凝。另取3支試管，取全血100 μl，分別加入小鼠抗人CD3-FITC、抗CD8-APC和抗PD-1-PE單克隆抗體（美國BD公司）10 μl，于4℃避光環境下孵育30 min，加入10倍稀釋后的紅細胞裂解液2 ml，室溫避光靜置15 min。待紅細胞完全溶血后，加入緩沖液，重復洗滌3次。另取2%多聚甲醛300 μl重懸細胞，立刻上流式細胞儀檢測，應用BD Cell Quest軟件對數據進行分析。

1.3 統計學處理應用SPSS 19.0軟件分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗，以P＜0.05表示兩組間差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組人群外周血CD8+T細胞PD-1/PD-L1表達水平比較與健康人比，AIH患者血CD8+T細胞PD-1和PD-L1分子陽性百分比均顯著升高（P＜0.01，表1）。

表1 兩組人群外周血CD8+T細胞PD-1/PD-L1表達水平（%，±s）比較

表1 兩組人群外周血CD8+T細胞PD-1/PD-L1表達水平（%，±s）比較

與健康人比，①P＜0.01

例數PD-1+/CD8+PD-L1+/CD8+AIH252.6±0.1①2.1±0.8①健康人250.5±0.20.4.±0.1

2.2 不同性別AIH患者血CD8+T細胞PD-1/PD-L1表達水平比較10例男性AIH患者血CD8+T細胞PD-1/PD-L1表達陽性百分比分別為（1.4±0.5）%和（2.3±0.6）%，顯著低于15例女性患者【（3.8±0.8）%和（2.5±0.5）%），P＜0.05）。

2.3 不同疾病分期AIH患者血CD8+T細胞PD-1/PD-L1表達水平比較給予所有患者強的松0.8～1.0 mg·kg-1·d-1治療，4周后逐漸減量。所有患者經治療后谷丙轉氨酶降低，球蛋白及膽紅素水平下降，達到緩解。AIH患者在緩解期PD-1/PD-L1表達水平分別為（3.3±0.2）%和（2.8±0.3）%。

3 討論

PD-1是最近新發現的CD28家族中的一種抑制傳導信號的共刺激分子，它不僅具有調節T細胞分化的功能，可以活化T淋巴細胞[8，9]。盡管PD-1共刺激分子與細胞毒性T淋巴細胞抗原4在氨基酸分子結構上面具有23%的同源性，但在表達方面PD-1卻與其很不一致，在活化的B細胞、T細胞和髓系細胞上PD-1具有更多的表達[10]，提示在免疫調節方面PD-1比CTLA-4作用范圍更廣。由于PD-1可以與其配體PD-L1互相作用，通過細胞胞漿尾部免疫受體，使得效應性或記憶性T淋巴細胞功能和首次免疫應答水平降低，從而起到負性調控抑制免疫反應的作用[11,12]。有大量的實驗觀察證明PD-1不僅對T細胞細胞因子的分泌、增殖方面起到抑制作用，而且對T細胞的免疫殺傷能力等方面也存在一定程度的抑制，故通過阻斷上述免疫抑制通路便可以在一定程度上恢復T細胞的功能[13，14]。病毒特異性CD8+T細胞PD-1表達水平在HIV、慢性HBV、HCV感染患者中明顯升高，故HIV、慢性HBV、HCV感染患者由于免疫功能受到抑制，導致患者處于長期慢感染狀態[15]。在機體免疫應答的初始和效應階段，PD-1/PD-L1通路起到抑制作用而達到避免機體因免疫過強導致自身免疫性疾病的發生[16]。

本研究從性別和疾病分期的角度出發，通過對AIH患者血CD8+T淋巴細胞PD-1表達水平進行檢測，從而探討PD-1在AIH發病過程中的作用和意義。研究結果顯示，與健康對照人群相比，AIH患者血CD8+T細胞PD-1表達水平明顯升高，且兩組間差異有明顯統計學意義。上述結果提示可能是AIH患者自身免疫反應的代償作用使得PD-l表達水平升高，但機體的代償作用并不能控制病情的進一步發展，病情并無好轉。除此之外，AIH患者發病期PD-1表達水平略低于緩解期，但差異并無統計學意義，提示糖皮質激素等免疫抑制劑治療的功效可能是由于PD-1通路的表達水平增加。在自身免疫性疾病方面，PD-1/PD-L1通路可以起到一定的預防作用，上級刺激信號的持續時長以及信號強弱等與其通路活化后的表達水平密切相關。在性別方面，不同性別的AIH患者和健康對照人群血CD8+T淋巴細胞PD-1表達水平有所差異，PD-1通路活化后的表達水平在女性群體中表達較男性群體高，但兩組人群差異并無統計學意義，對于女性人群較易出現自身免疫肝炎的原因則需進一步研究。

綜上所述，自身免疫性肝炎的發病可能與PD-1表達水平密切相關。對AIH患者體內PD-1通路表達增強的研究有重要的臨床意義，通過檢測AIH患者外周血PD-1的表達程度，可以作為一種參考指標診斷患者體內存在一定程度的免疫功能紊亂。本研究未對PD-1在B淋巴細胞以及其它細胞亞群的表達水平進行檢測，其對免疫功能的影響也需要進一步研究。

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（收稿：2016-09-26）

（本文編輯：陳宗炳）

Programmed cell death-1 and programmed cell death-1 receptor on peripheral blood CD8+T lymphocytes in patients with autoimmunehepatitis

Rui Zhilian.Clinical Laboratory，People’s Hospital，Liyang 213300，Jiangsu Province，China

Autoimmune hepatitis；CD8+T lymphocytes；Programmed cell death-1；Programmed cell death-1 ligand

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.03.025

213300江蘇省溧陽市人民醫院檢驗科

芮志蓮，女，49歲，大學本科，副主任技師。E-mail：ruizhilian3480@126.com