非小細胞肺癌組織中Slitrk5的表達及意義

孫金鵬，田濤，陳玲，劉燕春，孔繼昌

(1滄州中西醫結合醫院，河北滄州061000；2華北石油管理局總醫院；3滄州市醫學高等?？茖W校)

非小細胞肺癌組織中Slitrk5的表達及意義

孫金鵬1，田濤2，陳玲3，劉燕春2，孔繼昌2

(1滄州中西醫結合醫院，河北滄州061000；2華北石油管理局總醫院；3滄州市醫學高等?？茖W校)

目的 觀察非小細胞肺癌(NSCLC)組織中Slitrk5的表達情況，探討其與患者臨床病理特征的關系。方法 收集69例NSCLC患者手術切除的癌組織及癌旁組織，采用qRT-PCR法檢測Slitrk5 mRNA表達，免疫組化染色法觀察Slitrk5蛋白表達情況，Western blot法檢測Slitrk5蛋白表達量，并分析Slitrk5蛋白高表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系。結果 癌組織中Slitrk5 mRNA及蛋白表達均顯著高于癌旁組織(P均<0.05)。Slitrk5蛋白高表達在NSCLC患者不同性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、病理分型及有無淋巴結轉移間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。結論 Slitrk5在NSCLC肺癌組織中高表達，可能與NSCLC的發生相關。

非小細胞肺癌；神經跨膜蛋白；Slitrk5；腫瘤分化程度

Slitrk蛋白家族是一類調節神經細胞突起生長的因子，能夠控制軸突生長、調節神經元生長發育，在神經元細胞中過表達時，會導致軸突生長受到抑制。近年研究發現，Slitrk蛋白家族與腫瘤的發生發展有關。Slitrk3和Slitrk4在腦腫瘤中高度表達，尤其是在惡性程度高的腫瘤中，Slitrk4高表達更為明顯[1]；Slitrk3在淋巴瘤組織中表達上調[2]，在胃腸道間質瘤中的表達上調，且與胃腸道間質瘤的分級和預后相關[3]；Slitrk6在膀胱癌、肺原發癌和轉移性癌、乳腺癌和膠質母細胞瘤中呈陽性表達[4]，可作為晚期胃腸腫瘤一個潛在的治療靶點[5]，同時也是尿路上皮癌生物標志物ASG-15ME的靶基因[6]。然而有關Slitrk5在實體瘤中作用的研究較少。非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要病理類型，患者一經確診多為晚期，預后極差[7]。分子靶向治療對NSCLC的診療具有重要意義。本研究觀察了Slitrk5在NSCLC組織中的表達，并探討其與NSCLC臨床病理特征的關系，旨在為NSCLC的分子靶向治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月～2016年1月滄州中西醫結合醫院住院手術的69例NSCLC患者，男45例、女24例，年齡35～81歲、中位年齡60歲。均經術后病理檢查確診，術前未進行化放療。根據2004版WHO肺腫瘤分類標準，鱗癌30例、腺癌30例、腺鱗癌6例、大細胞肺癌3例；伴周圍淋巴結轉移52例，無周圍淋巴結轉移17例；TNM分期Ⅰ期7例，Ⅱ～Ⅲ期62例。取手術切除的癌組織和相應的癌旁正常組織(距癌組織邊緣≥2 cm)，4%甲醛中性緩沖液固定，常規石蠟包埋，4 μm連續切片。

1.2 Slitrk5 mRNA檢測 采用熒光定量PCR(qRT-PCR)方法。取組織標本，用TRIzol試劑提取總RNA，反轉錄合成cDNA。以各組cDNA為模板，進行qRT-PCR反應。Slitrk5上游引物：5′-TATTTACACACCACCCCGGC-3′，下游引物：5′-TGGGACACTCCAAAGGCAC-3′；內參GAPDH上游引物：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物:5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。反應體系：模板2 μL，2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 7 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸30 s，72 ℃后延伸7 min，共40個循環。使用2-ΔΔCt分析法進行數據分析。以目的基因與內參基因表達比值表示目的基因表達量，實驗重復3次。

1.3 Slitrk5蛋白定性檢測 石蠟標本60 ℃烘烤2 h，采用EnVision二步法進行免疫組化染色。雙氧水阻斷內源性過氧化物酶，加入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中，90 ℃微波抗原修復8 min；5%二抗正常血清室溫孵育封閉2 h；Slitrk5鼠抗人一抗(1∶200)室溫孵育1 h后4 ℃過夜；聚合物增強劑室溫孵育20 min，酶標抗鼠聚合物室溫孵育25 min，常規DAB顯色。以PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性片作陽性對照。以細胞膜呈棕色染色為陽性細胞。在光學顯微鏡×400視野下，每個樣本選取5個視野，觀察陽性細胞所占比例，無陽性細胞計0分，1%～10%計1分，11%～50%計2分，51%～80%計3分，>80%計4分。以≥3分為高表達，<3分為低表達。

1.4 Slitrk5蛋白定量檢測 采用Western blot法。取新鮮冰凍肺癌組織和癌旁組織，用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測定濃度，取50 μg蛋白進行電泳，SDS-PAGE電泳后電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加一抗鼠抗人Slitrk5抗體/鼠抗人β-Tubulin抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，加二抗HRP標記的抗兔IgG抗體(1∶5 000)孵育1 h，ECL化學發光法顯色。采用Image J分析圖像，以Slitrk5/β-Tubulin灰度比值表示Slitrk5蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 Slitrk5 mRNA在癌組織和癌旁組織中的表達比較 Slitrk5 mRNA在癌組織和癌旁組織中的相對表達量分別為5.32±0.57、1.26±0.37，二者比較P<0.05。其中55例(79.7%)癌組織中Slitrk5 mRNA表達高于癌旁組織。

2.2 Slitrk5蛋白在癌組織和癌旁組織中的表達情況比較 Slitrk5蛋白在癌組織中的高表達率為72.5%(50/69)，在癌旁組織中的高表達率為15.9%(11/69)，二者比較P<0.05。

2.3 Slitrk5蛋白在癌組織和癌旁組織中的表達量比較 Slitrk5蛋白在癌組織和癌旁組織中的相對表達量分別為0.768 3±0.265 0、0.218 9±0.072 2，二者比較P<0.05。

2.4 Slitrk5蛋白高表達與患者臨床病理參數的關系 Slitrk5蛋白高表達與患者性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、病理分型及有無淋巴結轉移均無關(P均>0.05)。見表1。

3 討論

Slitrk蛋白家族在氨基酸鏈末端的跨膜結構域有2個富含亮氨酸的重復序列結構，并與軸突導向因子Slit高度同源，其C末端結構與神經營養受體原肌球蛋白受體激酶(Trk)具有高度同源性[8，9]，Slitrk蛋白可以介導類似于Trk受體的一些生物功能，如神經突向外生長和樹突細化，突出形成和神經元存活[10，11]。人類Slitrk5蛋白是一種Ⅰ型跨膜蛋白，包含958個氨基酸，定位于中樞神經系統突觸，介導突觸的形成[12，13]。Slitrk5主要在神經組織表達，具有調節神經突活動的作用。前人對Slitrk5的研究主要集中在精神疾病領域[14]。新近研究發現，Slitrk5作為TrkB信號共受體，可以通過調控TrkB的內吞后回收，從而促進腦源性神經營養因子(BDNF)依賴的信號轉導[15]。BDNF/TrkB信號轉導途徑及其下游信號通路(PI3K/Akt、MAPK和PLC)與腫瘤細胞的增殖、浸潤及轉移密切相關[16]。Slitrk5的同源蛋白Slitrk3、Slitrk5、Slitrk6均已證明在腫瘤組織中表達異常，與腫瘤的發生發展相關，但目前尚無有關Slitrk5在實體瘤中表達情況的報道。

表1 Slitrk5蛋白高表達與患者臨床病理特征的關系(例)

本研究顯示，Slitrk5蛋白在NSCLC組織中的高表達率為72.5%，顯著高于癌旁組織；qRT-PCR、免疫組化染色及Western blot檢測發現，Slitrk5在癌組織中的mRNA及蛋白表達均高于癌旁組織，但Slitrk5蛋白高表達與患者性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、病理分型、淋巴結是否轉移無關。表明Slitrk5在NSCLC組織中表達升高，Slitrk5蛋白高表達可能與NSCLC的發生相關，但與NSCLC的發展及轉移無明顯相關。這種不相關性可能與基礎細胞的增殖、存活能力相關，但還需要進一步的研究來驗證。除此之外，Slitrk5蛋白在NSCLC惡性過程的分子機制和功能還尚不清楚，還需要深入研究。

綜上所述，NSCLC組織中Slitrk5高表達，可能與NSCLC的發生有關，Slitrk5可作為NSCLC的分子靶向治療的相關靶點，在NSCLC基因治療中具有一定的臨床應用前景。

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