羊蹄根對免疫性血小板減少性紫癜模型小鼠轉化生長因子-β1及其受體的影響

高 飏， 蔣祖軍

(廣州軍區廣州總醫院血液科， 廣東 廣州 510010)

羊蹄根對免疫性血小板減少性紫癜模型小鼠轉化生長因子-β1及其受體的影響

高 飏， 蔣祖軍

(廣州軍區廣州總醫院血液科， 廣東 廣州 510010)

目的：通過建立免疫性血小板減少性紫癜模型(ITP)小鼠，觀察羊蹄根提取物對小鼠外周血轉化生長因子(TGF-β1)以及受體的影響，對羊蹄根提取物的免疫調節機制進行探討。方法：將40只BALB/C小鼠隨機分為4組，分別是陽性對照組、模型組、羊蹄根提取物組、陰性對照組。除陰性對照組外，其余各組均采用腹腔注射豚鼠抗小鼠血小板血清(APS)的免疫造模方法進行ITP造模。采用實時PCR方法及Western Blot法檢測給藥前與給藥14d后各組小鼠的TGF-β1、受體TGF-βR表達量的變化。結果：與陰性對照組比較，模型組TGF-β1的表達量明顯升高(P<0.05)；TGF-β1mRNA以及TGF-β1蛋白表達量明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，羊蹄根提取物組TGF-β1的表達量明顯偏低(P<0.05)；TGF-β1mRNA以及TGF-β1蛋白表達量明顯偏高(P<0.05)。結論：羊蹄根提取物對ITP造模小鼠免疫功能具有調節作用，具體通過影響TGF-β1以及受體實現。

羊蹄根提取物； 血小板減少性紫癜； 模型小鼠； 轉化生長因子-β1； 受 體

免疫性血小板減少性紫癜是自身免疫性疾病，主要是一種由于抗血小板抗體介導的網狀內皮系統破壞引發的出血現象，與機體自身免疫系統失調引起血小板數目減少有關[1]。ITP的發病機制尚未闡明，但目前普遍認為與某些影響免疫活性細胞因子的作用有關[2]。轉化生長因子β1是一種影響細胞分化、生長、凋亡以及免疫的多功能蛋白，可以通過結合于細胞表面或該蛋白的受體發揮其作用，據報道，TGF-β1及其受體的表達量會影響ITP的發病[3,4]。據報道，羊蹄根提取物具有治療小鼠血小板減少癥的作用[5]。本研究采用RT-PCR檢測給藥前與給藥14d后各組小鼠的TGF-β1、受體TGF-βR表達量的變化，Western Blot檢測TGF-β1受體蛋白表達，探討羊蹄根提取物對ITP小鼠的免疫調節作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：SPF級BALB/C小鼠40只，體重范圍18～22g，雌雄各半。普通級豚鼠4只，體重范圍300～350g，由山東大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK-(魯)20140011。

1.2 主要試劑：完全福氏佐劑和不完全福氏佐劑(美國Sigma公司產品)；羊蹄根提取物采自于吉林市郊區，經粉碎采用乙醚，提取后使用濃度為0.5g生藥/kg；醋酸潑尼松片(天津太平洋制藥有限公司)。

1.3 豚鼠抗血小板抗血清的制備[6]：采用乙醚麻醉BALB/C小鼠后用EDTA-Na 2進行抗凝，于小鼠心臟取血并分離血小板、洗滌，用生理鹽水進行稀釋，并與等量完全福氏佐劑混合，注射于豚鼠皮下、足掌及背。采用不完全福氏佐劑于1、2、4周重復上述操作，第5周開始進行豚鼠心臟采血，分離抗血小板抗血清(APS)。

1.4 造模[7]：采用注射APS方法建立小鼠ITP模型，于本個月內隔天腹腔注射1：4稀釋的APS，劑量為100μL/20g。

1.5 試驗分組方法：40只BALB/C小鼠隨機分為4組，每組10只，分別陽性對照組、模型組、羊蹄根提取物組、陰性對照組。除陰性對照組外，其余均進行ITP造模。其中陰性對照組與模型組小鼠灌胃給予等量0.9%氯化鈉溶液；陽性對照組小鼠灌胃給予醋酸潑尼松，劑量為5mg/kg；羊蹄根提取物組小鼠灌胃給予羊蹄根提取物提取物，劑量為0.5g(生藥)/kg。

1.6 TGF-β1及TGF-β受體(TGF-βR)mRNA表達的RT-PCR法檢測：細胞中TGF-β1及其受體提取方法依照TRIzol說明書進行，采用紫外分光光度儀進行純度與濃度的檢測，A 260 nm /A 280 nm> 1.8。PCR 引物由上海生物工程有限公司合成(見表 1)。cDNA 的合成方法參照M-MLV 逆轉錄酶的說明書。PCR 反應體系 20 μL。

表1 PCR 檢測TGF-β1及其受體的引物

1.7 Western Blot檢測TGF-β1受體蛋白表達：提取脾組織蛋白后使用酚試劑測定蛋白濃度。將制備的4%濃縮膠以及10%分離膠、marker和待測樣品各50μL上樣。于硝酸纖維素膜上轉印，且先后與一抗和二抗孵育、顯色劑顯色后用FlourChem V 2.0凝膠成像軟件分析結果，分析條帶吸光度相對值進行比較。

1.8 統計學方法：采用SPSS 19.0統計分析軟件對數據進行處理分析，其中計量數據用均值±標準差表示，比較可采用兩獨立樣本t檢驗，組間比較采用Q檢驗，血小板計數采用重復方差檢驗。認為P<0.05時，具有統計學意義。

2 結 果

2.1 ITP模型的評價：根據上述方法進行小鼠造模，由圖1可見，造膜前后模型組小鼠血小板數目持續減低，與造模前相比具有統計學差異(F=7.462, P<0.01)，說明造模成功，可用于后續研究，見表1。

表2 造膜前后模型組小鼠血小板數目對比

表3 不同組別間ITP模型小鼠轉化生長因子-β1(TGF-β1)及其受體含量變化

注：與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖1 ITP模型小鼠外周血血小板數量的變化

2.2 羊蹄根提取物對ITP模型小鼠轉化生長因子-β1(TGF-β1)及其受體含量變化的影響：經研究發現，模型組小鼠的TGF-β1水平高于陰性對照組，且具有統計學差異(P<0.05)。采用陽性對照藥及羊蹄根提取物給藥治療后，陽性對照組及羊蹄根提取物組小鼠血清TGF-β1水平較模型組相比明顯降低，且具有統計學差異(P<0.05)。且羊蹄根提取物組降低TGF-β1作用較陽性對照組明顯(P<0.01)，說明羊蹄根提取物對ITP模型小鼠TGF-β1水平作用明顯，可以有效促進血小板的生成。具體結果見表2。Western Blot檢測TGF-β1受體蛋白表達圖見圖2。

圖2 不同組TGF-β受體的表達電泳圖

3 討 論

免疫性血小板減少性紫癜是一種無明顯外因導致血小板數目減少以及皮膚黏膜出血的獲得性免疫疾病。數年來人們對該病發病機制不斷進行研究，結果發現ITP病因可能是T細胞亞群功能改變、T細胞的異常激活、血小板膜糖蛋白的結構的改變以及的巨核細胞及血小板成熟障礙等，但具體發病機制尚未闡明。

近年來，隨著人們對轉化生長因子β1的不斷研究與認識，認為該因子及其受體體內表達量的差異會對ITP的發病有所影響[8,9]。主要表現為對巨核細胞及血小板在增殖、分化以及成熟階段的負性作用影響[10]。本研究中也同樣得到證實，ITP模型組小鼠體內TGF-β1的表達量明顯高于陰性對照組小鼠，TGF-β1mRNA以及TGF-β1蛋白的表達量明顯低于陰性對照組小鼠，且均具有統計學意義，說明TGF-β1及其受體的表達量的變化為一種ITP的發病機制。模型小鼠的TGF-β1及其受體的表達量會受到病情變化影響。

研究表明[11]羊蹄跟中含有的大黃酚能夠對家兔以及小鼠的血凝時間具有縮短作用，且可以增強促進骨髓制造血小板，提高體內血小板含量。同時羊蹄根提取物因其清熱解毒的作用，可以有效緩解激素引起的不良反應,降低毒副作用，提高療效。本研究針對羊蹄根提取物的抗凝特性，通過在ITP小鼠模型上采用羊蹄根提取物干預治療，從轉化生長因子-β1變化機制方面對羊蹄根提取物治療ITP小鼠的療效進行探討。據文獻報道，潑尼松對TGF-β1及其受體有明確作用，因此研究中采用該藥作為陽性對照藥[12]。結果表明，羊蹄根提取物通過影響轉化生長因子-β1及其受體的表達量，對ITP小鼠免疫功能具有一定恢復作用，且與陽性藥醋酸潑尼松相比效果更為明顯，因此可以作為ITP治療的新型手段。

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Effects of Rumex Japonicus Houttextract on Transforming Growth Factor-β1and Receptors in Thrombocytopenic Purpura Mice

GAOYang,JIANGZujun

(TheGenenralHospitalofPLAinGuangzhouMilitaryArea,GuangdongGuangzhou, 510010China)

Objective:To observe the effects of Rumex japonicus Houtt extract on transforming growth factor-β1and its receptors in thrombocytopenic purpura mice model. Methods: 40 BALB/C mice were randomly divided into positive control group, model group, rumex japonicus houtt extract group and negative control group. All ITP mouse model were made by injected guinea pig-antimouse platelet serum (GP-APS) except negative control group. The expressions of TGF-β1and their receptors TGF-βR in the peripheral blood of mice were detected by the real-time PCR and Western Blot, and differences of their expression levels were analyzed. Results: The expression of TGF-β1in ITP model group was significantly higher than that in the negative control group (P<0.05), while the TGF-β mRNA and TGF-β protein expression in ITP model group were significantly lower than that in the negative control group (P<0.05). The expression of TGF-β1in rumex japonicus houtt extract group was significantly lower than that in the ITP model group (P<0.05), while the TGF-β mRNA and TGF-β protein expression in rumex japonicus houtt extract group were significantly higher than that in the ITP model group (P<0.05). Conclusion: Rumex japonicus houtt extract can regulate the immune function of ITP by in fluencing the expression of transforming growth factor-β1and its receptors.

Rumex japonicus houtt extract; Immune thrombocytopenic purpura; Model mouse; Transforming growth factor-β1; Receptors

1006-6233(2017)05-0741-04

廣東省科技計劃項目，(編號：2013B0313441)

蔣祖軍

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.05.011