固相萃取定量核磁共振波譜法測定板藍根飲片中的表告依春

劉曉婷++禹珊++袁銘++郭強勝++龔燦++許旭

摘要建立了固相萃?。⊿PE）定量核磁共振波譜（qNMR）技術測定板藍根飲片中有效成分表告依春含量的方法。樣品用水超聲提取兩次，采用SPE對提取液進行富集濃縮，用qNMR測定表告依春的含量?？疾炝藰悠奉A處理和qNMR實驗條件對測定結果的影響，選擇氘代二甲基亞砜為溶劑，用基準試劑鄰苯二甲酸氫鉀標定的2，3，5三碘苯甲酸為內標，選擇脈沖寬度P1=14.1 μs，延遲時間d1=5 s，掃描次數NS=256為qNMR定量測定表告依春的最佳實驗條件。表告依春的定量峰為δ 5.365～5.399 （H7b， d，1H）。結果表明，日內測量精密度（RSD）為0.5%，日間精密度為0.8%，表告依春與三碘苯甲酸峰面積比與質量比的零截距標準曲線線性相關系數為0.9991，且斜率與理論值相符。根據響應值標準偏差和標準曲線斜率法確定此法測定表告依春的檢測限（LOD）為0.05 mg/g；定量限（LOQ， S/N ≥ 150）為0.19 mg/g。包括樣品提取過程的表告依春的回收率為97.4%～101.7%。采用本方法測定板藍根飲片中的表告依春的含量為<0.19～1.26 mg/g。研究結果表明，采用SPE進行富集，擴大了qNMR的應用范圍，可用于低含量復雜樣品的定量分析。

關鍵詞定量核磁共振波譜法； 固相萃??； 表告依春； 板藍根

1引 言

定量核磁共振波譜法（qNMR）不依賴于被測物的高純度標準品、不破壞樣品，僅需樣品組分有1個或1組互不干擾的特征NMR峰，依據信號峰的面積正比于產生該共振峰的質子數，即可進行定量分析，具有獨特的優勢＼[1～4＼]。近年來qNMR方法被廣泛用于新藥研制＼[1，5，6＼]、中藥＼[7，8＼]與化學藥＼[9～11＼]的質量控制、代謝組學＼[12～14＼]等研究。繼美國藥典（19版）、英國藥典（1975年版）、日本藥局方（12版）和歐洲藥典（第5版）之后，中國藥典從2010版開始，將此技術作為法定標準收載于通則（附錄）中＼[15，16＼]。

板藍根是十字花科草本植物菘藍（Isatis Indigotica Fort）的干燥根，被載入中國藥典一部，廣泛用于流行性感冒、乙肝等病毒性疾病的防治，具有抗菌、抗病毒、抗內毒素、調節免疫等作用＼[17，18＼]。研究表明，其水提物、醇提物、總生物堿具有較強抗流感病毒作用，其中表告依春被認為是抗流感病毒的主要有效成分之一＼[19＼]。目前監測板藍根中表告依春的主要方法為HPLC法＼[20～23＼]，但這些方法都需要表告依春標準品做為對照品，成本較高。

采用qNMR方法測定中藥中有效成分常存在靈敏度低和干擾強的問題。Yang等＼[8＼]通過加入氘代三氟乙酸，將原來互相干擾的定量峰分開，來消除干擾。禹珊等＼[24＼]將提取的樣品旋干后溶于少量氘代試劑，通過提高濃度來改善靈敏度。固相萃?。⊿PE）作為一種有效的樣品預處理技術，具有濃縮（富集）和樣品凈化功能，操作簡便＼[25，26＼]。將SPE與qNMR結合，有助于解決靈敏度低和干擾強的問題。Pieri等＼[27＼]將樣品提取物用C18SPE柱凈化富集后，以氘代DMSO洗脫，用qNMR內標法測定了朝鮮薊葉提取物中的萊薊苦素，并進行方法認證（沒有評價SPE回收率）。Li等＼[28＼]將收集的42種黨參樣品提取后，經C18SPE柱處理，用qNMR測定了四種生物堿，但在低濃度測定回收率時的精密度較差。Moura等＼[29＼]將加入內標的樣品溶液用C18SPE柱凈化富集后，用qNMR測定環境和生物樣品中的βN甲基氨基L丙氨酸。其它應用還包括測定飲茶后人體尿液中的代謝物＼[30＼]、污染水中的原油和正己烷＼[31＼]、地下水中的污染物＼[32＼]等。

本研究采用SPE技術凈化和富集板藍根飲片提取物，建立SPEqNMR測定表告依春含量的方法。研究結果表明，采用SPE進行富集，擴大了qNMR的應用范圍，可用于低含量復雜樣品的定量分析。本方法在實際測定樣品時無需對照品。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Bruker AVANCE III 500 MHz核磁共振譜儀（德國Bruker公司）；U3000高效液相色譜儀（美國ThermoFisher公司）；M2p高精密天平（精度0.001 mg， 德國Startoriu公司）；AB204N精密天平（精度0.1 mg， 上海世義精密儀器有限公司）；PS20超聲波清洗儀（東莞潔康公司）；800B高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；DC12氮吹儀（上海安譜科學儀器有限公司）。PolySery MCX固相萃取柱（500 mg，6 mL，上海安譜實驗科技股份有限公司）；Kromasil高效液相色譜C18色譜柱（150 mm × 4.6 mm， 瑞典Akzo Nobel公司）。

表告依春（Epigoitrin，阿法埃莎（天津）化學有限公司）；2，3，5三碘苯甲酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；鄰苯二甲酸氫鉀（基準物質，99.95%～100.05%，上海泰坦科技股份有限公司）；氘代二甲基亞砜（d6DMSO，99.9%）和氘代硫酸（99.5%）均為Cambridge Isotope Lab. Inc.產品；甲醇（HPLC級，阿達瑪斯試劑有限公司）；正己烷、乙酸、醋酸銨為國產分析純；磷酸、氨水為國產優級純。實驗用水為蒸餾水。

板藍根飲片的3個樣品均購自本地中藥房，藥材產地分別為甘肅、江蘇和安徽。其中樣品3有蟲蛀現象。

2.2實驗方法

2.2.1樣品處理將板藍根飲片磨碎，過篩，精確稱取1 g左右，加入50 mL水，稱重，60℃超聲提取45min，放冷后再稱重，加水補充損失質量，4000 r/min離心5 min，收集上清液。殘渣再加入50 mL水，重復上述提取步驟。合并兩次上清液，過濾并棄去初濾液，收集50 mL續濾液。

依次用6 mL甲醇、6 mL蒸餾水、6 mL乙酸乙酸銨緩沖溶液（pH 4.7）活化PolySery MCX固相萃取柱（500 mg，6 mL）。將50 mL上述續濾液過柱，流速控制在3 s滴加1滴。用6 mL正己烷分3次淋洗柱子，每次2 mL。最后用6 mL 氨水甲醇（5∶95， V/V）溶液洗脫，洗脫液用N2吹至約0.1 mL，加入約0.4 mL氘代DMSO，再加入準確稱重的2，3，5三碘苯甲酸作為內標，混勻后轉移至核磁管中。

2.2.2HPLC檢測條件參考2015版中國藥典＼[17＼]，選擇用于考察SPE操作方法的HPLC檢測條件為：Kromasil 1005C18色譜柱（150 mm × 4.6 mm），流動相為甲醇0.02% H3PO4（7∶93， V/V）；流速1.0 mL/min； 進樣量10 μL；柱溫30℃； 檢測波長245 nm。

2.2.3定量核磁共振測定核磁共振（NMR）數據采集條件：脈沖序列zg30。脈沖寬度（P1）14.1 μs，延遲時間（D1）5 s，掃描次數（NS）256次，譜寬（SW）20 ppm，中心頻率（O1）3090 Hz，采樣時間（AQ） 3.17 s，室溫（約25℃）條件下測定NMR圖譜。積分前先調平NMR基線，選擇對應的峰的積分區間，每個峰積分3～5次，相對標準偏差（RSD） < 1%時取平均值。采用中國藥典的絕對定量公式計算待測組分的含量Ws＼[15，16＼]：

Ws = Wr×（As/Ar）×（Es/Er）（1）

其中， Wr 為稱取得內標物的質量， As 和Ar 分別為供試品和內標峰的峰面積， Es 和Er 分別為供試品和內標物的質子當量重量（質量）。

3結果與討論

3.1樣品制備方法的選擇

3.1.1樣品提取條件的優化文獻報道的板藍根藥材（飲片）的提取方法主要有回流法＼[33＼]、煎煮法＼[34＼]和超聲波輔助提取法＼[20～23＼]，其中應用最廣的是超聲波輔助提取法。本研究采用2.2.2節的HPLC檢測條件，考察了提取條件對SPE的影響。

比較了煎煮和超聲提取兩種方法對表告依春的提取效率。煎煮法采用中國藥典2015版一部板藍根供試品溶液的制備方法＼[17＼]，重復提取兩次。超聲提取法按照2.2.1節的方法提取。用HPLC測定煎煮提取液中表告依春的峰面積，結果表明，均明顯小于超聲提取液的峰面積，所以后續實驗選擇超聲提取方法。

取超聲提取兩次的殘渣，再次超聲提取，提取液中表告依春的峰面積約為第一次提取的1/70。因此，本實驗選定的提取次數為2次。

選擇超聲波提取方法， 考察了超聲時間（10～120 min）對表告依春的提取情況的影響。超聲提取45 min時，表告依春峰面積較高，繼續延長超聲提取時間，響應值差異不大。故超聲提取時間選擇45 min。

3.1.2固相萃取條件的選擇表告依春溶解在水中呈弱堿性。比較了MCX柱（混合型強陽離子交換柱）、C18柱兩種SPE柱的效果。C18柱在上樣和淋洗過程中均有大量表告依春流出，而MCX 柱對表告依春有較好保留，因此選用 MCX 固相萃取柱。

分別采用 100 mmol/L乙酸（pH 2.9）、2.5 mmol/L乙酸（pH 3.7）和乙酸乙酸銨緩沖溶液（pH 4.7）活化MCX 固相萃取柱。使用前兩種溶液時，表告依春在上樣時都會流出，而乙酸乙酸銨緩沖溶液能使表告依春在上樣時完全保留在柱上，所以選擇乙酸乙酸銨緩沖溶液活化柱子。將50 mL續濾液過柱，取第5～50 mL流出液檢測，均未檢測到表告依春。

考察甲酸0.1 mol/L乙酸（1∶1， V/V）、乙酸乙酸銨緩沖溶液、水、冰水、乙酸乙酯、二氯甲烷、四氫呋喃、正己烷、異丙醇和無水乙醚對MCX 柱子淋洗的影響。結果表明，使用冰水和正己烷時，表告依春的保留效果最好，其中使用正己烷時完全沒有漏出。故選擇使用正己烷為淋洗劑。

考察了甲醇5%氨水（1∶1， V/V）、甲醇氨水（95∶5， V/V）、氨水對表告依春的洗脫效果，最終選擇甲醇氨水（95∶5， V/V）溶液為洗脫劑，用量為6 mL。

綜上所述，固相萃取的最終條件為：6 mL甲醇、6 mL蒸餾水、6 mL乙酸乙酸銨緩沖溶液（pH 4.7） 活化；板藍根續濾液50 mL上樣；用6 mL正己烷淋洗；6 mL 氨水甲醇（5∶95， V/V）洗脫。

3.2氘代試劑的選擇

將得到的6 mL洗脫液用氮氣吹干，分別考察了氘代二甲基亞砜和氘代氯仿對所得產物的溶解性，結果表明，氘代二甲基亞砜能很好地溶解產物，而氘代氯仿并不能夠完全溶解產物。所以選擇氘代二甲基亞砜作為溶劑。

3.3內標物的選擇

除2，3，5三碘苯甲酸外，其它常用內標物，如鄰苯二甲酸氫鉀、順丁烯二酸、反丁烯二酸、對苯二甲醛、苯甲酸等的部分峰均與表告依春樣品峰有重疊，因此選擇2，3，5三碘苯甲酸作為內標物。

3.4信號歸屬及定量峰的選擇

3.4.1NMR峰歸屬用2.2.3節的方法分別測定表告依春（）、內標以及兩者混合物的NMR譜圖。參考文獻＼[35＼]，歸屬混合物（圖1C）中的各信號峰， 表告依春峰： δ 3.818～3.857 （H4， t，1H）和δ 3.431～3.396 （H4′，t，1H）； δ 5.310～5.324 （H5， q，1H）； δ 5.343～5.356 （H7a（順式）， d，1H）； δ 5.400～5.434 （H7b（反式）， d，1H）； δ 5.950～6.018 （H6， m，1H）。2，3，5三碘苯甲酸峰： δ 7.748～7.746 （d，1H）； δ 8.333～8.335 （d，1H）。

3.4.2定量峰確認測定樣品1的NMR圖譜，與樣品內標混合物圖譜（圖2C）比較。此時，內標峰位置由δ 7.748～7.746 （d，1H）和δ 8.333～8.335 （d，1H）移至δ 7.313～7.314 （d，1H）和δ 7.994 （d，1H），發生了明顯變化?？紤]到洗脫液為堿性，在樣品中加入氘代硫酸后再測試NMR譜圖，發現加入少量氘代硫酸即可以使化學位移回復到原來位置，單獨采用標樣也有同樣現象，從而確認這種變化的原因是SPE洗脫劑含有的氨水成分，提高了NMR待測樣品溶液pH值，造成NMR峰的偏移。Fan等＼[36＼]也用氘代鹽酸調節溶液pH值，改變特征峰的化學位移?？紤]樣品NMR譜在δ 7.9～8.0化學位移處基線較平坦（圖2B）， δ 7.994（d，1H）與樣品峰沒有重疊，所以選擇其為內標峰（圖2C中信噪比較高的峰1）。在此實驗條件下，NMR峰分離完全，可以滿足qNMR測定要求，后續的定量實驗中未用氘代硫酸調節pH值。

因此，選擇內標峰δ 7.994（d，1H）對應的積分范圍為δ 7.962～8.022 （圖2C中IS1），定量峰δ 5.365～5.399（d，1H）對應的積分范圍為δ 5.339～5.420 （圖2C中的1）。積分范圍的選擇方法為在對應質子峰起止處放大圖譜，取峰形輪廓線與完全水平的基線剛好重合處為起止點，并固定每組峰的積分范圍。

3.4.3NMR實驗參數的影響 分別考察了脈沖寬度P1、延遲時間d1和掃描次數NS對積分面積的影響。當P1≥14.1 μs， d1=5 s， NS≥256時，信噪比可以達到定量要求（S/N≥150），且Ar與As趨于穩定。故選定核磁參數P1=14.1 μs， d1=5 s， NS=256。3.4.4對2，3，5三碘苯甲酸和表告依春純品的含

量校正在2.2.2節實驗條件下，以氘代DMSO為溶劑，基準物質鄰苯二甲酸氫鉀的NMR峰δ 7.493～7.511 （H4，5，dd，2H）與三碘苯甲酸和鄰苯二甲酸氫鉀純品的NMR定量峰互不干擾。采用qNMR絕對定量模式對兩種純品進行含量校正。重復實驗6次，取平均值。實驗測得2，3，5三碘苯甲酸含量為99.94%，RSD為0.6%；表告依春純品含量為97.53%，RSD為0.9%。以下驗證實驗中這兩種化合物使用校正后的含量值。

3.5方法驗證

3.5.1精密度取樣品1，按照2.2.1節樣品預處理方法制成待測樣品，按照2.2.3節方法測得日內精密度（RSD）為0.5%（n=6），日間RSD為0.8%（n=6），表明qNMR較好的精密度以及樣品良好的穩定性。

3.5.2線性與分析性能稱取10組表告依春樣品（0.5805～1.215 mg）和約1.5 mg內標，超聲溶于0.5 mL氘代DMSO中，按2.2節方法測定NMR譜圖。以表告依春與三碘苯甲酸質量比為橫坐標（x），兩者的峰面積比為縱坐標（y），線性擬合。零截距標準曲線：y=3.7785x， r=0.9991 （不過原點的擬合方程為： y=3.7734x+0.0036， r=0.9991。根據公式（1）計算表告依春線性曲線的理論斜率（Es/Er）為3.8691，而實驗中得到的斜率與其接近，說明可以采用絕對定量公式（1）計算表告依春的含量。

3.5.3檢出限和定量限根據2015版中國藥典四部通則＼[15＼]，qNMR的檢出限LOD和定量限LOQ由基于響應值標準偏差和標準曲線斜率法的公式LOD= 3.3 σ/S，（LOQ）= 10σ/S 得到，式中σ在本實驗采用標準曲線的剩余標準偏差計算。表告依春的LOD=0.029 mg， LOQ=0.088 mg。根據實驗中內標的用量1.5 mg以及溶劑0.5 mL，計算得qNMR測定表告依春的LOD=0.09 g/L，LOQ=0.26 g/L?？紤]到信噪比對qNMR的重復性影響較大，英國藥典＼[37＼]對核磁定量方法要求信噪比S/N≥150，文獻＼[28＼]中較低信噪比時重復實驗的精密度RSD>2%，因此將其作為qNMR確定LOQ的指標是合理的，以樣品1的NMR譜峰信噪比，根據公式（1）計算得表告依春的LOQ=0.37 g/L。取兩者均滿足的較大值，可以認為本方法qNMR對表告依春的LOQ=0.37 g/L，LOD=0.09 g/L。按照本實驗中約0.5 mL的溶劑量和約1 g板藍根的樣品量，可以算出本SPEqNMR法測定板藍根中表告依春含量的LOD=0.05 mg/g；LOQ=0.19 mg/g，相當于0.019% （w/w）。因此，通過SPE濃縮和富集分析物，顯著提高了qNMR檢測的靈敏度。

3.5.4表告依春的回收率分別準確稱取4份各約1 g已知表告依春含量的樣品，在每份樣品中均加入準確稱定的表告依春，用2.2節的方法提取并測定含量，計算回收率，結果見表1，表告依春回收率為97.42%～101.70% ，RSD=2.0% （n=4）。

3.6樣品分析

實際樣品的測定結果見表2。樣品1和樣品2符合2015版中國藥典規定板藍根飲片中的表告依春的含量測定不低于0.02%的要求＼[17＼]，樣品3可能是蟲蛀的影響其含量偏低，不能滿足藥典的要求。

4結論

建立了固相萃取qNMR測定板藍根飲片中的表告依春含量的方法，本方法精密度好，線性評價表明，可以直接采用絕對定量公式計算含量，定量分析結果準確。本方法將SPE與qNMR結合，通過凈化樣品和濃縮待測組分，提高了qNMR的定量分析靈敏度，有利于擴展qNMR的應用范圍。

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