高效液相色譜化學發光法檢測牛奶中磺胺類藥物殘留

段婕++李興華++劉坤++張淑娟++馬莉++石紅梅

摘要 以4種磺胺類藥物（ulfonamides， As）， 即磺胺脒（ulfaguanidine， GD）、磺胺嘧啶（sulfadiazine， DZ）、磺胺噻唑（sulfathiazole， Z）和磺胺二甲嘧啶（ulfamethazine，MZ）為分析物，基于其在堿性介質中對Ag配合物魯米諾（Luminol）與Ni配合物魯米諾兩化學發光體系發光強度均具有抑制作用的性質，建立了高效液相色譜化學發光法檢測牛奶中4種磺胺類藥物的方法。將化學發光體系作為高效液相色譜的新型檢測器，并對兩種化學發光體系的檢測器性能進行了比較。4種磺胺藥物經高效液相色譜分離后，分別與AgLuminol及NiLuminol化學發光體系作用。色譜條件為：反相C18分離柱（250 mm × 46 mm，5 μm）； 01%甲酸甲醇為流動相（V/V）； 梯度洗脫； 流速1 mL/min?；瘜W發光條件：Ag、NiLuminol兩體系中，Ag配合物濃度14×10

ymbolm@@ 4 mol/L（含012 mol/L NaO）； Ni配合物濃度15×10

ymbolm@@ 5 mol/L（含012 mol/L NaO）； Luminol濃度均為12×10

ymbolm@@ 7 mol/L； 試劑流速均為10 mL/min。在最佳的分離檢測條件下，AgLuminol體系檢測4種磺胺類藥物的檢出限分別為015、096、110和150 μg/mL，加標回收率為810%～1015%； NiLuminol體系檢測GD、DZ、Z 3種磺胺類藥物的檢出限分別為15、172和168 μg/mL，加標回收率為839%～1108%。相比之下，AgLuminol體系作為高效液相色譜檢測器更佳。應用本方法對牛奶中4種磺胺類藥物殘留量進行檢測，結果令人滿意。

關鍵詞 高效液相色譜； 化學發光； Ag配合物； Ni配合物； 磺胺類藥物

1引 言

磺胺類藥物（ulfonamides，As）為人工合成的一類抗菌藥物，在獸醫臨床上廣泛用于預防和治療動物細菌感染性疾病，常用磺胺藥物有磺胺脒（ulfaguanidine，GD）、磺胺嘧啶（ulfadiazine，DZ）、磺胺噻唑（ulfathiazole，Z）、磺胺二甲嘧啶（ulfamethazine，MZ）等。動物飼養過程中若長期使用抗生素類藥物，會使動物體內致病細菌產生耐藥，給動物疾病檢疫與防治帶來不利影響，且會使藥物殘留在動物體內?；前奉愃幬餁埩羝陂L，在畜禽等動物源性食品中的殘留，嚴重危害食品安全與公眾健康。

文獻報道了許多用于檢測動物源性食品中磺胺類藥物多組分殘留的方法，其中以高效液相色譜法（igh performance liquid chromatography，PLC）應用最普遍[1]。反相PLC連接紫外（UV）＼[2＼]、二極管陣列（DAD）＼[3＼]、熒光（FL）＼[4＼]檢測器廣泛用于食品、環境中As殘留的例行分析，PLCM/M以其高靈敏度及選擇性用于檢測或確證分析中＼[5，6＼]。UV、DAD檢測器用于磺胺類及其它抗生素殘留檢測時靈敏度受限； FL檢測器靈敏度高，但As需柱前衍生，合適的衍生試劑不易篩選； M或M/M檢測器最有優勢，但儀器及運行成本的壓力，使其不易普及。

近年來，化學發光分析法（Chemiluminescence，CL）以其靈敏度高、線性范圍寬、儀器設備簡單、分析速度快等優點，廣泛用于環境、生物、生化樣品分析中＼[7～9＼]。魯米諾（Luminol）體系是最經典的化學發光體系＼[10～12＼]，其發光機理為：魯米諾在堿性條件下被氧化劑氧化，氧化產物吸收氧化還原反應放出的熱量后被激發，激發態回到基態輻射發光。本課題組在前期研究中發現，過渡金屬超常氧化態與適當多齒配體絡合形成的配合物，在一定條件下能穩定存在并具有較強的氧化性能，如Ag和Ni與過碘酸形成的配合物＼[Ag（IO6）2＼]5

ymbolm@@ ， ＼[Ni（IO6）2（O）2＼]

ymbolm@@ 6在堿性條件下是良好的氧化劑＼[13～16＼]。將Ag、Ni配合物與魯米諾組成化學發光體系，通過待測組分對Ag、NiLuminol發光體系的增敏或抑制作用，已成功用于β2受體激動劑、皮質醇等多種藥物或生物分子的檢測，且具有極高的靈敏度＼[17，18＼]。

化學發光靈敏度高，但方法的選擇性差。若將PLC的高效分離能力與CL的高靈敏性結合，首先采用PLC將混合物中的各組分得到有效分離，再利用化學發光檢測系統對各組分進行靈敏檢測，是一種兼顧高靈敏度與高分辨力的物質分離與檢測新方法。本實驗以動物源性食品中最易殘留的4種磺胺類藥物，即磺胺脒、磺胺嘧啶、磺胺噻唑和磺胺二甲嘧啶為分析物，基于其對AgLuminol與NiLuminol兩化學發光體系發光強度均具有抑制作用的性質，建立了PLCCL檢測體系同時分離分析牛奶中4種磺胺類藥物的方法，并對兩種檢測器的性能進行了比較，為PLC法在抗生素殘留檢測中新檢測器的開發提供了思路。同時，對比AgLuminol與NiLuminol兩體系在檢測靈敏度及檢測穩定性等方面的不同，以期更好地與高效液相色譜聯用。

2實驗部分

21儀器與試劑

PD15C高效液相色譜儀（島津公司 ）； IFFME型流動注射化學發光分析儀（西安瑞邁分析儀器有限責任公司）； B5200D超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）； U1901型雙光束紫外可見分光光度計（北京普析儀器公司）； N500超聲波信號發生器（上海汗諾儀器有限公司）。

磺胺脒（GD）、磺胺嘧啶（DZ）、磺胺噻唑（Z）、磺胺二甲嘧啶（MZ），純度>98%，均購于德國Dr Ehrenstorfer公司； 魯米諾（日本CI公司）； 甲醇（瑞典Oceanpa公司）等。甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

GD、DZ、Z、MZ儲備溶液：稱取適量GD、DZ、Z、MZ標準品，用40%甲醇配制成10 mg/mL 的標準儲備液。其中磺胺嘧啶配制過程中加入幾滴01 mol/L NaO溶液促進溶解，

ymbolm@@ 4℃保存。使用時，以純水稀釋至所需濃度。

魯米諾儲備溶液：稱取適量魯米諾標準品，溶于10 mol/L NaO溶液中，以超純水定容。

Ag和Ni配合物儲備液分別依據文獻＼[19，20＼]制備，＼[Ag（IO6）2＼]5

ymbolm@@ 儲備液濃度由其362 nm處的摩爾吸光系數（ε=126×104 L·mol

ymbolm@@ 1·cm

ymbolm@@ 1）測定得到。依據＼[Ni（IO6）2（O）2＼]6

ymbolm@@ 配合物在410 nm處的摩爾吸光系數（ε=106×105 L·mol

ymbolm@@ 1·cm

ymbolm@@ 1）測定儲備液中Ni配離子濃度。工作液均用超純水稀釋。

22高效液相色譜化學發光檢測裝置

本實驗系統由高效液相分離裝置和化學發光檢測體系裝置通過三通接頭和聚四氟乙烯管連接而成。液相部分由高壓輸送泵、進樣系統、色譜柱等組成，化學發光部分由蠕動泵、光電倍增管、檢測池等組成。實驗通路如圖1所示：樣品由六通閥進樣后，經色譜柱分離、進入檢測器，與此同時Ag或Ni與魯米諾溶液經三通閥“5”處混合并發生反應，流經三通閥“6”時與樣品溶液混合，進入檢測池檢測發光強度。

色譜條件： C18色譜柱（250 mm×46 mm， 5 μm）； 流動相01%甲酸甲醇混合液，甲醇用前以微孔有機濾膜（045 μm）過濾，01%甲酸溶液用微孔水系濾膜（045 μm）過濾，超聲脫氣； 流速： 10 mL/min； 溫度：30℃； 進樣量：20 μL。梯度洗脫程序見表1。 化學發光條件：試劑流速10 mL/min； ＼[Ag＼]=14×10

ymbolm@@ 4 mol/L； ＼[Ni＼]=15×10

ymbolm@@ 5 mol/L； ＼[NaO＼]=012 mol/L； ＼[Luminol＼]=12×10

ymbolm@@ 7 mol/L； L1=3 cm， L2=2 cm。

23樣品處理

根據國家標準方法＼[21＼]，取樣品（50±05） mL，置于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入25 mL 01% ClO4溶液，用水調節至p 2，于渦旋振蕩器振蕩提取1 min，超聲波萃取10 min，備用。LB固相萃取柱依次用3 mL甲醇和5 mL 01% ClO4 （p 2）活化，取備用液過柱，再用5 mL 超純水淋洗，抽干，用3 mL甲醇洗脫。收集洗脫液，于40℃氮氣吹至02 mL，甲醇01%甲酸（1∶19，V/V）溶液補至10 mL，過045 μm濾膜過濾，待測。

3結果與討論

31高效液相色譜條件的優化

初步實驗表明，在本實驗體系中，高效液相色譜有機相的比例對化學發光體系的影響較大，當甲醇或乙腈的有機相的比例過大時，一方面造成PLCCL體系的基線噪聲大，且重復性較差，另一方面，由于高效液相色譜裝置與化學發光裝置通過有機玻璃三通閥連接，甲醇、乙腈等有機溶劑易腐蝕玻璃，對實驗設備及實驗結果產生一定影響，故在實驗過程中應控制高效液相色譜中有機相的比例。

PLC法測定磺胺類藥物的流動相體系主要有：乙酸乙腈，甲醇磷酸鹽溶液等＼[22～26＼]。實驗發現，乙腈磷酸鹽、甲醇乙酸及甲醇甲酸體系均能使4種磺胺類物質得到較好的分離，但結合化學發光體系表明，乙腈較甲醇對化學發光信號的影響較大，乙酸較甲酸對化學發光信號的影響較大，均造成基線不穩定、噪聲大等情況，故最終確定流動相為甲醇01%甲酸。

進一步研究表明，隨著甲醇比例的增大，化學發光信號的基線噪聲隨之增大。且由于磺胺脒柱上的保留較弱，為使4種檢測物質均能在最佳時間內出峰，采用了梯度洗脫程序。綜合考慮分離效果及化學發光信號穩定情況，采用表1梯度洗脫程序，流速10 mL/min時，4種被檢物質均能在25 min之內流出，且峰形良好，同時保證了對化學發光信號穩定程度的影響最小。

32化學發光條件的優化

321化學發光裝置流路參數的選擇在其它條件一定的情況下，考察了試劑流速對信噪比的影響。結果表明，試劑流速在10 mL/min時信噪比為最佳。

322Ag和Ni濃度的優化考察了50×10

ymbolm@@ 5～20×10

ymbolm@@ 4 mol/L濃度范圍內的Ag和50×10

ymbolm@@ 6～30×10

ymbolm@@ 5 mol/L的Ni配合物濃度對光強及信噪比的影響（圖2）。結果表明，隨著Ag和Ni濃度增大，化學發光信號逐漸增大。但隨著信號的增強，信噪比隨之減小。當Ag和Ni的濃度分別為14×10

ymbolm@@ 4 mol/L和15×10

ymbolm@@ 5 mol/L時，兩體系中被測物質相對化學發光信號較強，信噪比最大，最終確定此濃度為實驗最佳濃度。

323Ag和Ni配合物溶液中NaO濃度的優化分別考察Ag和Ni配合物溶液中NaO濃度（005～030 mol/L）對AgLuminol和NiLuminol化學發光體系相對化學發光強度的影響。結果表明，NaO濃度增加，4種磺胺類藥物對兩種體系的化學發光強度的抑制作用增強，且噪聲隨之增大，當NaO濃度為012 mol/L時，磺胺類藥物對兩種體系的化學發光信號的抑制作用最強，且信號穩定，信噪比較大（圖3）。故本實驗最終選擇Ag和Ni配合物溶液堿度均為012 mol/L。

324魯米諾溶液濃度的優化在50×10

ymbolm@@ 8～20×10

ymbolm@@ 7 mol/L范圍內考察魯米諾溶液濃度對化學發光信號強度及噪聲的影響（圖4）。結果表明，隨著魯米諾濃度升高，相對化學發光強度逐漸增大。但當其濃度為15×10

ymbolm@@ 7 mol/L時，基線噪聲顯著上升，造成信號不穩定，影響峰高，且信噪比逐漸減小。故實驗中最佳魯米諾濃度選擇為12×10

ymbolm@@ 7 mol/L。

33工作曲線、精密度與檢出限

在優化的條件下，對磺胺類物質系列標準溶液進行測定，回歸方程、檢出限等參數見表2和表3。檢出限的峰高值為3倍的基線噪聲（/N=3）。對樣品進行7 次平行測定，兩體系相對標準偏差分別為10%～21%和10～19%。

34AgLuminol及NiLuminol化學發光機理推斷

Ag、Ni過碘酸配合物在堿性介質中均為良好的氧化劑，Ag配合物氧化還原電位E=174 V＼[26＼]， 較Ni配合物的電位高，氧化能力更強。氧化目標物時，Ag反應速度較Ni配合物快，但實驗表明，Ni配合物氧化體系更穩定； 分別與魯米諾組成化學發光體系后，Ag體系較Ni體系更靈敏，但Ni體系檢測范圍更廣。

采用AgLuminol和NiLuminol兩化學發光體系作為PLC檢測器對磺胺類藥物進行檢測時，前者更為靈敏，檢出限明顯較低，線性范圍較寬，而Ni檢測體系較前者穩定性好。Ag與Ni的氧化能力與其濃度、NaO濃度有關，隨著配合物濃度增大，AgLuminol體系及NiLuminol體系的化學發光強度呈增強降低再增強再降低的趨勢，這可能與配合物在不同條件下配位平衡發生改變，從而影響其氧化能力有關。

據前期研究＼[27，28＼]推斷，此檢測體系可能的檢測機理為：在堿性介質中，

作為氧化劑的Ag及Ni配合物與魯米諾組成化學發光體系，配合物氧化魯米諾產生化學發光，即為基線信號（I0）。4種磺胺類藥物經PLC分離后進入CL檢測體系，分別與兩化學發光體系作用，產生發光信號（It），且對基線強度均有抑制作用，相對減弱強度ΔI（ΔI =I0-It） 與磺胺藥物濃度C呈線性關系。Ag、Ni配合物和魯米諾及磺胺藥物的反應均為自由基反應，

1， GD； 2， DZ； 3， Z； 4， MZ而磺胺類藥物與Ag和Ni配合物的反應速率較與魯米諾反應速率慢，反應過程中，魯米諾產生的自由基轉移給磺胺類藥物一部分，從而使魯米諾的自由基減少，發光體的量減少，使得體系的發光強度降低。

35樣品分析和回收率實驗

在優化的條件下，對處理過的牛奶樣品進行了測定。5份購于超市的牛奶樣品，均未檢出4種磺胺類物質，對照高效液相色譜紫外檢測器法，結果為未檢出。按照已優化的條件對加標后處理過的樣品進行分離測定，圖5為PLCAgLuminol測定牛奶中4種磺胺類藥物色譜圖。

取牛奶樣品9份， 依次加入4種磺胺類物質標準品，每份樣品按照樣品前處理的方法進行處理，制得低、中、高 3 種濃度水平的加標樣品，每份樣品平行測定3次（表4和表5），計算得回收率為810%～1108%。

上述結果表明，采用Ag魯米諾和Ni魯米諾兩化學發光體系作為高效液相色譜新型檢測器，適用于食品中磺胺類藥物殘留的檢測，為高效液相色譜法新檢測器的開發提供了參考。

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