枸杞多糖對腦出血大鼠神經細胞凋亡及凝血酶受體-1表達的影響

鄒有瑞，霍國進，王軍成，吳 橋，沈 冰

·論 著·

枸杞多糖對腦出血大鼠神經細胞凋亡及凝血酶受體-1表達的影響

鄒有瑞1，霍國進2，王軍成3，吳 橋3，沈 冰1

目的 觀察枸杞多糖(LBP)對大鼠腦出血(ICH)后神經細胞凋亡及凝血酶受體-1(PAR-1)表達的影響，并探討其可能機制。方法 將72只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、LBP低劑量、中劑量、高劑量組(50、100、200 mg/kg)和尼莫地平組10 mg/kg。各給藥組給予相應劑量藥物灌胃，假手術組、模型組給予等體積生理鹽水替代，1 次/d，共15 d。灌胃結束后，采用二次自體血注入法建立ICH模型；采用TUNEL法檢測神經細胞凋亡，采用Western Blot、免疫組化、qRT-PCR，從不同水平探索LBP對ICH后腦組織PAR-1表達的影響。結果 模型組神經細胞凋亡率、PAR-1陽性率、PAR-1蛋白的表達及PAR-1 mRNA的表達較假手術組顯著增加(P<0.05)，LBP各劑量組神經細胞凋亡率、PAR-1陽性率、PAR-1蛋白的表達、PAR-1 mRNA的表達較模型組均有不同程度的減低(P<0.05)。相關性分析顯示，ICH后神經細胞凋亡率與PAR-1陽性率呈正相關性。結論 LBP能夠抑制大鼠ICH引起的神經細胞凋亡，對ICH后腦組織具有保護作用，其機制可能與抑制PAR-1表達有關。

枸杞多糖；腦出血；細胞凋亡；凝血酶受體-1

腦出血(ICH)占急性腦血管病的20%～30%，其死亡率和病殘率均較高，嚴重威脅著人類的健康[1]。ICH的病理生理機制復雜，ICH后繼發性損傷是導致神經功能損傷的重要因素。最新研究表明，細胞凋亡在其中扮演著重要角色[2]。此外，凝血酶也在其中起著關鍵作用，它可以作用于腦組織內凝血酶受體-1(PAR-1)而發揮細胞毒性作用[3]。枸杞多糖(LBP) 是我國傳統名貴中藥枸杞的主要活性成分。最新研究證實，LBP具有減輕腦組織缺血再灌注損傷、降低氧自由基損傷、保護神經細胞、抑制神經元凋亡、改善學習記憶能力等功能[4-5]，這些研究主要集中在腦缺血、糖尿病等方面，但在ICH領域的相關研究罕見報道。本研究將觀察LBP對ICH后神經細胞凋亡及PAR-1表達的影響，并探討其可能機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物：健康雄性SD大鼠72只，體重(200±30)g，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供[合格證號：SCXK(寧)2500-001],符合實驗動物倫理學要求。

1.2 主要試劑：LBP(銀川泰豐生物科技有限公司，批號：G20140917,含量>32%)，全蛋白提取試劑盒，BCA蛋白含量檢測試劑盒，兔抗鼠PAR-1 抗體(abcam 公司)，山羊抗兔熒光二抗(Proteintech公司)，免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒，TUNEL試劑盒(Roche公司)，Trizol(ambion公司),反轉錄試劑盒(Thermo 公司)，Maxima SYBR Green/Pox qPCR Master Mix(2×)(Thermo公司)。

1.3 主要儀器：Narishige腦立體定位儀，分析天平(Mettler Toledo)，酶標儀(Bio-Tek)，紅外熒光掃描成像系統(Odyssey)，實時熒光定量PCR儀，低溫離心機(Eppendorf)，石蠟切片機(Thermo),熒光顯微鏡(Olympus)，普通顯微鏡 (Olympus)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組與給藥：將健康雄性SD大鼠72只，隨機分為假手術組、模型組、LBP低劑量組(50 mg/kg)、LBP中劑量組(100 mg/kg)、LBP高劑量組(200 mg/kg)、尼莫地平組(10 mg/kg)，每組12只。各大鼠給予相應劑量的藥物連續灌胃，1 次/ d，連續灌胃15 d，假手術組與模型組給予等體積的生理鹽水替代。

1.4.2 ICH模型的制備：選擇二次注入法制作ICH模型[6]，大鼠用10%水合氯醛麻醉(38 mg/kg)，俯臥位固定于立體定位儀上。固定大鼠頭部，調整高度使大鼠前后囟處于同一水平，以30號針頭通過顱骨鉆孔進入左側基底節區(前囟后0.6 mm，左旁開3 mm，深度5.8 mm)。分2次緩慢注射大鼠自體血60 L(間隔時間2 min)，注射完畢后停針5 min，分2次緩慢退針(間隔時間2 min)。假手術組以同樣的方法，注射60 μl生理鹽水。手術結束，骨蠟封閉針孔，消毒縫合頭皮，各組大鼠分籠飼養，正常飲食。

1.4.3 TUNEL技術檢測細胞凋亡：造模后48 h，斷頭取腦，切取進針孔前與進針后腦組織，用于制作腦組織石蠟切片。利用TUNEL法檢測細胞凋亡[7]，熒光顯微鏡下觀察分析結果(藍色熒光反應細胞總數、綠色熒光反應凋亡細胞數)，隨機攝高倍鏡下6個視野,分析凋亡細胞陽性率。

1.4.4 腦組織中PAR-1蛋白表達的檢測：造模后48 h斷頭取腦，切取出血區腦組織100 mg，提取腦組織中全蛋白，所提取的全蛋白利用SDS-PAGE凝膠電泳進行分離，并轉移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h后，加入兔抗鼠PAR-1抗體(1∶2 000 )4 ℃孵育過夜,抗GAPDH(1∶3 000)為內參對照4 ℃孵育過夜；TBST清洗后加入山羊抗兔熒光二抗(1∶5 000)室溫下孵育1 h，TBST清洗后應用Odyssey紅外熒光掃描成像系統對膜進行掃描，得到Western Blot條帶圖。利用Gelpro32圖像分析軟件獲取各個條帶的灰度值，以GAPDH作為內參進行比較分析，得出結論。

1.4.5 免疫組化檢測腦組織中PAR-1蛋白的表達：取前面制作的腦組織石蠟切片，進行免疫組化染色。用DAB顯色試劑盒檢測抗原抗體反應，蘇木素復染，脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結果。隨機選取6個視野拍照，分別計算各組PAR-1陽性細胞比例，統計分析得出結論。

1.4.6 qRT-PCR檢測腦組織PAR-1 mRNA的表達：造模后48 h斷頭取腦，置于-80 ℃冰箱保存待測。利用Trizol提取大鼠腦組織總RNA，將所提取的RNA反轉錄為cDNA，采用qRT-PCR技術分別測定各組大鼠腦組織PAR-1mRNA的表達。PCR所用引物由生物公司設計，PAR-1引物序列：Forward primer：5’-GAGACAG CCAGAA TCTGA GAGG-3’；Reverse primer：5’- TAAGTAGA CTGCCCT GCCCT -3’；片段長度166 bp；內參對照GAPDH引物序列：Forward primer：5’-GACAT GCCGCCTG GAGAAAC-3’，Reverse primer：5’-AGCCCA GGATGCCCT TTAGT -3’，片段長度20 bp。PCR反應體系25 μl：Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(2×) 12.5 L；模板cDNA；大鼠PAR-1/GAPDH上下游引物；無核酸酶的水補充至25 L。置于預冷的伯樂八連管中，混勻離心后上機進行熱循環擴增。本研究以GAPDH為內參基因，用2-ΔΔCt法[8]進行相對定量分析，統計分析并制作箱式圖。

2 結果

2.1 LBP對ICH后神經細胞凋亡的影響：假手術組于腦組織針道周圍可見TUNEL陽性細胞，散在分布且數量少，其余各組TUNE陽性細胞明顯增多。與假手術組比較模型組TUNEL陽性細胞率明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，LBP組與尼莫地平組TUNEL陽性細胞率明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠Tunel陽性細胞的比較(個，±s)

注：*與假手術組比較，P<0.05；#與模型組比較，P<0.05。

2.2 LBP對ICH后腦組織中PAR-1蛋白表達的影響：模型組大鼠腦組織中PAR-1蛋白表達量較假手術組顯著增高(P<0.05)；與模型組比較，各LBP給藥組PAR-1蛋白表達量均顯著降低(P<0.05)，表明LBP可以降低ICH后腦組織中PAR-1蛋白的表達，見圖1(目錄后)。

2.3 免疫組化檢測LBP對ICH后腦組織PAR-1表達的影響:PAR-1的表達主要分布于神經元及神經膠質細胞的細胞質中，模型組的PAR-1陽性細胞率顯著高于假手術組(P<0.05)；與模型組比較，LBP中劑量組、高劑量組PAR-1陽性細胞率顯著降低(P<0.05)，見圖2(目錄后)。

2.4 LBP對ICH后腦組織PAR-1 mRNA表達的影響：與假手術組比較，模型組PAR-1 mRNA的表達量顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，LBP組PAR-1 mRNA的表達量顯著降低(P<0.05)，其中以LBP中劑量組下降最為明顯，而LBP各劑量組之間比較差異無統計學意義，見圖3(目錄后)。

2.5 ICH后腦組織神經細胞凋亡率與PAR-1陽性細胞率的相關性分析：ICH后腦組織神經細胞凋亡率與PAR-1陽性細胞率呈正相關性，Pearson相關系數(r)為0.865(P<0.05)。

3 討論

ICH的病理生理機制復雜，ICH后繼發性損傷是導致神經功能損傷的重要因素，細胞凋亡在其中扮演著重要角色。目前，ICH缺乏循證醫學確切有效的治療手段，減輕出血后可出現繼發性腦損傷，因此尋找切實有效的神經保護藥物一直是ICH研究領域的重要課題。LBP是枸杞中提取的主要活性成分，它抑制神經細胞凋亡的作用已經在許多領域得到證實[4-5,9-10]，因此，猜想LBP也能抑制ICH引起的神經細胞凋亡。

本研究選擇二次自體血注入法建立大鼠ICH模型，并在此基礎上，利用TUNEL實驗證實ICH能夠引起神經細胞凋亡，且神經細胞凋亡多發生在出血區及其周圍腦組織中，與其他學者實驗結果相符[11]。該實驗同時證實LBP能夠抑制ICH引起的神經細胞凋亡，這種凋亡抑制作用在LBP中劑量組較為明顯。LBP通過抑制ICH引起的神經細胞凋亡，進而保護ICH后腦組織。

ICH引起神經細胞調亡的機制尚不清楚，有很多因素能夠誘發細胞凋亡，例如凝血酶、血紅蛋白的分解、炎細胞的浸潤等[12]。最新研究表明，PAR-1作為凝血酶受體家族中最主要的亞型，長期大量存在于ICH后血腫周圍組織中，它具有神經細胞毒性作用[13-14]，參與凝血酶相關的諸多病理生理過程[15]，ICH后腦組織PAR-1表達的變化是凝血酶直接作用的結果[16]。因此，研究LBP對腦組織PAR-1表達的影響成了本實驗的又一重要內容。

為了深入地了解LBP對ICH后神經細胞中PAR-1表達的影響，使用Western Blot、免疫組化、qRT-PCR等實驗技術，從不同層面進行了探索，結果顯示ICH后出血區及其周圍腦組織中PAR-1蛋白的表達、PAR-1陽性細胞比例、PAR-1mRNA的表達顯著增加，LBP能夠在一定程度上抑制ICH引起的這種改變，表現為LBP各劑量組PAR-1蛋白的表達、PAR-1陽性細胞比例、PAR-1 mRNA的表達均較模型組顯著減少，尤以中劑量LBP的抑制作用最強。作為補充，我們利用SPSS軟件對腦組織神經細胞凋亡率與PAR-1陽性細胞率進行了相關性分析，證實ICH后神經細胞凋亡率與PAR-1陽性細胞率呈正相關性。

綜上所述，ICH后出血區及其周圍腦組織中可見神經細胞凋亡的發生與PAR-1表達的上調，而LBP不僅能夠抑制大鼠ICH引起的神經細胞凋亡，而且能夠抑制ICH后PAR-1的表達，進而對ICH后腦組織起到一定的保護作用，ICH后神經細胞凋亡率與PAR-1陽性細胞率呈正相關性關系。因此，LBP能夠抑制ICH引起的神經細胞凋亡，而這種抑制作用似乎與PAR-1有著某種內在聯系，其具體機制需要通過進一步的實驗去探索。

[1] Naval NS，Nyquist PA，Carhuapoma JR.Management of spontaneous intracerebral hemorrhage[J].Neurologic Clinics，2013，26(2)：373-384.

[2] Hwang BY，Appelboom G，Ayer A，et al.Advances in neuroprotective strategies：potential therapies for intracerebral hemorrhage[J].Cerebrovascular Diseases，2011，31(3)：211-222.

[3] 鄭國慶，黃漢津，王小同.腦出血后凝血酶的作用與抗凝血酶治療[J].國外醫學(腦血管疾病分冊)，2005，13(3)：199-202.

[4] Wang Tengfei，Li Yuxiang，Wang Yongsheng，et al.Lycium barbarum polysaccharide prevents focal cerebral ischemic injury by inhibiting neuronal apoptosis in mice[J].PLoS One，2014，9(3)：90780.

[5] Ho YS，Yu Manshan，Yang Xifei，et al.Neuroprotective effects of polysaccharides from wolfberry，the fruits of Lycium barbarum，against homocysteine-induced toxicity in rat cortical neurons[J].Journal of Alzheimer's Disease，2010，19(3)：813-827.

[6] Deinsberger W，Vogel J，Kuschinsky W，et al.Experimental intracerebral hemorrhage：description of a double injection model in rats[J].Neurological Research，1996，18(5)：475-477.

[7] Li SY，Fu Zhongjie，Ma Huan，et al.Effect of lutein on retinal neurons and oxidative stress in a model of acute retinal ischemia/reperfusion[J].Investigative Ophthalmology & Visual Science，2009，50(2)：836-843.

[8] Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-Delta Delta C(T)Method[J].Methods，2001，25(4)：402-408.

[9] Li SY，Yang Di，Yeung CM，et al.Lycium barbarum polysaccharides reduce neuronal damage，blood-retinal barrier disruption and oxidative stress in retinal ischemia/reperfusion injury[J].PLoS One， 2011，6(1)：16380.

[10] Gómez Rosso L，Benítez MB，Fornari MC，et al.Alterations in cell adhesion molecules and other biomarkers of cardiovascular disease in patients with metabolic syndrome[J].Atherosclerosis，2008，199(2)：415-423.

[11] Ardizzone TD，Zhan Xinhua，Ander BP，et al.SRC kinase inhibition improves acute outcomes after experimental intracerebral hemorrhage[J].Stroke，2007，38(5)：1621-1625.

[12] 王景周，周中和，李瑋，等.大鼠腦出血血腫周邊組織細胞凋亡的動態變化規律研究[J].中國臨床神經科學，2003，11(2)：124-127.

[13] Zheng Guoqing，Wang Xiaotong，Wang Xiumin，et al.Long-time course of protease-activated receptor-1 expression after intracerebral hemorrhage in rats[J].Neuroscience Letters，2009，459(2)：62-65.

[14] Xue Mengzhou，Hollenberg MD，Demchuk A，et al.Relative importance of proteinase-activated receptor-1 versus matrix metalloproteinases in intracerebral hemorrhage-mediated neurotoxicity in mice[J].Stroke，2009，40(6)：2199-2204.

[15] Luo Weibo，Wang Yingfei，Reiser G.Protease-activated receptors in the brain：receptor expression，activation，and functions in neurodegeneration and neuroprotection[J].Brain Research Reviews，2007，56(2)：331-345.

[16] Guan Jingxia，Sun Shenggang，Cao Xuebing，et al.Effect of thrombin on blood brain barrier permeability and its mechanism[J].Chinese Medical Journal，2004，117(11)：1677-1681.

Effect of Lycium Barbarum Polysaccharides on the neuronal apoptosis and protease-activated receptor-1 expression after Intracerebral hemorrhage

ZOUYourui1,HUOGuojin2,WANGJuncheng3,WUQiao3,SHENBing1.

1.DepartmentofNeurosurgery,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity，Yinchuan，750004,China;2.TheFirstHospitalofYulin,Yulin,719000,China;3.NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,750004,China

SHEBin，Email:shenbing315@sina.com

Objective To observe the effect of Lycium Barbarum Polysaccharides (LBP) on the neuronal apoptosis and protease-activated receptor-1(PAR-1) expression after Intracerebral hemorrhage (ICH) in order to discuss its possible mechanism.Methods 72 SD rats were randomly divided into sham-operated group，model group，LBP low/moderate /high dose group，nimodipine group(n=12).Preoperatively 15th,LBP low /moderate /high group were given LBP 50,100,200 mgokg-1 by gavage，nimodipine group was given nimodipine 40 mg/kg by gavage，sham group and model group were given the same amount of saline,which were given for 15 days,1 time per day,.After gavage,using autologous blood to inject caudate nucleus in order to build rat ICH model.The neuronal apoptosis was assessed by TUNEL assay.The impact of LBP on the PAR-1 expression was detected by Western Blot,immunohistochemistry and RT-PCR techniques.Results Neuronal apoptosis rate,PAR-1 positive rate,PAR-1 protein and PAR-1mRNA expression in the ICH group were significantly higher than sham-operated group(P<0.05).Neuronal apoptosis rate,PAR-1 positive rate，PAR-1 protein and PAR-1 mRNA expression in the each dose group of LBP were significantly lower than the ICH group(P<0.05).Correlation analysis confirmed a positive correlation between neuronal apoptosis rate and PAR-1 positive rate after ICH.Conclusion LBP can not only reduce the neuronal apoptosis,but also inhibit the expression of PAR-1 after ICH.It has a protective role in cerebral after ICH.

Lyciumbarbarumpolysaccharides;Intracerebralhemorrhage;Apoptosis;Protease-activatedreceptor-1

10.13621/j.1001-5949.2017.06.0481

寧夏科技支撐計劃項目(2013ZY8160)

1.寧夏醫科大學總醫院神經外科，寧夏 銀川 750004 2.陜西省榆林市第一人民醫院，陜西 榆林 719000 3.寧夏醫科大學，寧夏 銀川 750004

鄒有瑞(1985-)，男，蒙古族，內蒙古籍，醫學碩士，主治醫師，從事神經外科研究方向。

沈冰，Email:shenbing315@sina.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170614.1314.002.html

R285

A

2016-12-14 [責任編輯]王凱榮