卡那霉素對蘿卜種子發芽及幼苗生長的影響

張靜，李海萍

(1.山西農業大學 園藝學院，山西 太谷 030801； 2.西北農林科技大學 園藝學院， 陜西 楊凌 712100)

?

卡那霉素對蘿卜種子發芽及幼苗生長的影響

張靜1，李海萍2

(1.山西農業大學 園藝學院，山西 太谷 030801； 2.西北農林科技大學 園藝學院， 陜西 楊凌 712100)

[目的]為了篩選蘿卜種子卡那霉素最佳致死濃度。[方法]以2個蘿卜自交系為試材，研究了不同濃度卡那霉素對蘿卜種子發芽和幼苗生長發育的影響。[結果]卡那霉素對不同蘿卜自交系種子的萌發影響不同，但對蘿卜幼苗的生長發育都有明顯的抑制作用，隨著卡那霉素濃度的升高，致死率升高、主根和下胚軸長度變短。不同蘿卜品種對卡那霉素的敏感性不同，各自的致死濃度也不一樣。[結論]在經卡那霉素溶液浸泡后播種時，07Lb36-9和07Lb39的卡那霉素致死濃度分別為150 mg·L-1和300 mg·L-1，這2個濃度可以作為蘿卜自交系07Lb36-9和07Lb39的轉基因種子的篩選濃度。

蘿卜； 卡那霉素； 敏感性

蘿卜(RaphnussativusL.)屬于十字花科蘿卜屬一年或兩年生草本植物[1]，是油菜的近緣物種[2]。蘿卜在世界范圍內均有種植，且有著十分悠久的歷史，在人們日常生活中日益重要，逐漸成為科學研究的重要對象。隨著測序技術的飛速發展，許多物種基因組測序工作已經完成。2014年日本學者公布了蘿卜全基因組序列[3]，為深入分析蘿卜基因功能，進而改良蘿卜種質資源提供了極大便利。

國內外對于蘿卜的遺傳轉化研究起步較晚。Kim等[4]首次利用農桿菌介導的組織培養方法對蘿卜進行遺傳轉化研究并且獲得了成功。李海萍等[5]初步建立了基于組織培養的蘿卜遺傳轉化體系。但是農桿菌介導的組織培養遺傳轉化過程比較復雜，影響其轉化效率的因素較多。因此，不依賴于組織培養的轉化方法一直是相關領域的研究重點以及熱點。植株原位真空滲入法避開了組織培養的過程，具有很多優點，目前已在蘿卜[2]、油菜[6, 7]、甘藍型油菜[8]、擬南芥[9]、芥菜[10]、不結球白菜[11]和大白菜[12]上進行了嘗試，并獲得了成功。

植物原位真空滲入法轉化的假陽性率也很高，收獲的種子不可能全部進行分子檢測，所以對種子抗性篩選尤為重要。利用標記基因對大量轉基因后代進行鑒定和篩選是一種經濟簡便的方法[13]。本研究以2個蘿卜自交系為試材，研究不同濃度卡那霉素對其發芽和幼苗生長發育的影響，確定卡那霉素最佳致死濃度，以期為后續真空滲入法轉化蘿卜得到的種子進行抗生素篩選提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為2份蘿卜(RaphanussativusL.)材料，分別是自交系07Lb36-9和07Lb39，由西北農林科技大學園藝學院大白菜研究室提供。

1.2 試驗方法

分別制備含0、50、100、150、200、250和300 mg·L-1共7個梯度的卡那霉素MS選擇培養基(含蔗糖20 g·L-1、瓊脂7.5 g·L-1)。挑選顆粒飽滿的蘿卜種子，在超凈工作臺上首先用70%乙醇消毒1 min，其次用0.8%次氯酸鈉溶液消毒15 min，無菌水沖洗4～5次。然后將消毒的種子進行以下2種處理：(1)直接播種于含有相應濃度卡那霉素的MS選擇培養基上，對照為種子消毒后直接播種于不含卡那霉素的MS選擇培養基上，每個處理100粒，重復3次；(2)將消毒好的種子在含有相應濃度卡那霉素的水溶液中4 ℃浸泡36 h，然后播種于含相應濃度卡那霉素的MS選擇培養基上，對照為種子消毒后在無菌水中4 ℃浸泡36 h，然后播種于不含卡那霉素的MS選擇培養基上，每個處理100粒，重復3次。置于室溫25 ℃、光照時間為16 h·d-1、光照強度為2000 lux條件下培養。

1.3 項目測定

1.4 數據分析

數據測定結果用SAS軟件和Excel軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 卡那霉素對蘿卜種子發芽率的影響

由表1可見，直接播種時，低濃度的卡那霉素對07Lb36-9蘿卜種子的萌發有明顯促進作用，卡那霉素濃度在50 mg·L-1時，07Lb36-9的發芽率達到了87.26%，其它濃度范圍內對07Lb36-9蘿卜種子的萌發影響不顯著，各處理的發芽率均在65%以上；卡那霉素在0～150 mg·L-1濃度范圍內對07Lb39蘿卜種子的萌發影響不顯著，各處理的發芽率均在80%以上，卡那霉素在200～300 mg·L-1濃度范圍內對07Lb39蘿卜種子的萌發有顯著的抑制作用，且隨著卡那霉素濃度的升高，發芽率逐漸降低。

經卡那霉素溶液浸泡后播種時，卡那霉素在50～300 mg·L-1濃度范圍內對07Lb36-9蘿卜種子的萌發有促進作用，各處理的發芽率均在75%以上，且150～300 mg·L-1濃度范圍的卡那霉素對07Lb36-9蘿卜種子的萌發有顯著促進作用，隨著卡那霉素濃度的升高，發芽率逐漸升高；50～100 mg·L-1濃度范圍的卡那霉素對07Lb39蘿卜種子的萌發有顯著促進作用，而300 mg·L-1的卡那霉素對07Lb39蘿卜種子的萌發有顯著的抑制作用，其發芽率僅為69.38%，卡那霉素在150～250 mg·L-1濃度范圍內對07Lb39蘿卜種子的萌發影響不顯著。

2.2 卡那霉素對蘿卜幼苗下胚軸和主根生長的影響

2種播種方式下，卡那霉素在50～300 mg·L-1濃度范圍內對2種蘿卜材料的主根生長有顯著的抑制作用，且隨著卡那霉素濃度的升高，主根長度逐漸降低(圖1A)。

直接播種時，卡那霉素在50～300 mg·L-1濃度范圍內對2個蘿卜材料的下胚軸生長有抑制作用?？敲顾貪舛葹?50～300 mg·L-1時對07Lb36-9的下胚軸生長有顯著抑制作用，而卡那霉素濃度在100～300 mg·L-1時對07Lb39的下胚軸生長有顯著的抑制作用(圖1B)。

經卡那霉素溶液浸泡后播種時，卡那霉素在50～300 mg·L-1濃度范圍內對2個蘿卜材料的下胚軸生長有抑制作用?？敲顾貪舛葹?00～300 mg·L-1濃度時對07Lb36-9的下胚軸生長有顯著抑制作用，卡那霉素濃度在50～300 mg·L-1時對07Lb39的下胚軸生長有顯著的抑制作用(圖1B)。

表1 卡那霉素對蘿卜種子發芽率的影響

注:同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Note:Different lowercase letters in a column mean significant difference (P<0.05)

圖1 卡那霉素對蘿卜子葉苗主根 (A)和下胚軸(B)生長的影響Fig.1 The effect of kanamycin on the growth of root (A) and hypocotyls (B) of radish seedling 注：Z：直接播種于培養基；P：經卡那霉素溶液浸泡后播種于培養基。下同Note：Z: Seeds were sown in the medium directly without soaking in the kanamycin solution; P: Seeds were sown in the medium after soaking in the kanamycin solution. The same below

2.3 卡那霉素對蘿卜幼苗子葉顏色的影響

不同蘿卜品種的卡那霉素致死濃度不同。直接播種時，當卡那霉素濃度達到300 mg·L-1時對2個蘿卜品種的致死率雖然達到了90%以上，但是未達到100%(表1，圖2)。浸泡后播種時，07Lb36-9在卡那霉素篩選濃度為150 mg·L-1以上時幼苗子葉全部黃化，卡那霉素濃度在50 mg·L-1時的蘿卜幼苗生長狀況基本正常，部分子葉出現黃化(圖2)；因此，可以確定07Lb36-9在浸泡后播種的最低卡那霉素致死濃度為150 mg·L-1。而07Lb39對卡那霉素有較強的耐受性，卡那霉素濃度為300 mg·L-1時幼苗子葉全部變黃(圖2)。

圖2 不同蘿卜材料對卡那霉素的敏感性分析Fig.2 Analysis of the resistance to kanamycin of different radish inbred-line

3 討論與結論

近年來，科研工作者對蘿卜的遺傳轉化進行了研究，方法有組織培養法[4,5]和蘸花法[2,14]，說明應用真空滲入法進行蘿卜遺傳轉化是可以實現的。

卡那霉素對不同蘿卜自交系種子的萌發影響

不同。直接播種時，卡那霉素在50～150 mg·L-1濃度范圍內對07Lb36-9和07Lb39蘿卜種子的萌發影響不顯著，低濃度的卡那霉素對07Lb36-9蘿卜種子的萌發有促進作用，卡那霉素在200～300 mg·L-1濃度范圍內對07Lb39蘿卜種子的萌發有顯著的抑制作用；浸泡后接種時，150～300 mg·L-1濃度范圍的卡那霉素對07Lb36-9蘿卜種子的萌發有顯著促進作用，各處理的發芽率均在80%以上，50～100 mg·L-1濃度范圍的卡那霉素對07Lb39蘿卜種子的萌發促進作用顯著，而300 mg·L-1的卡那霉素對07Lb39蘿卜種子的萌發有顯著的抑制作用。這與油菜上[7]的研究結果有所差異。另外，2個蘿卜自交系均表現出隨著卡那霉素濃度的提高，致死率升高、主根和下胚軸長度變短的趨勢。這與油菜[7]、大白菜、小白菜和菜心的研究結果[13]一致。

本試驗研究了不同濃度卡那霉素對蘿卜種子發芽和幼苗生長發育的影響，初步確立了2個蘿卜自交系的卡那霉素致死濃度。不同蘿卜品種對卡那霉素的敏感性不同，各自的致死濃度也不一樣。在經卡那霉素溶液浸泡后播種的情況下，07Lb36-9和07Lb39的卡那霉素致死濃度分別為150和300 mg·L-1，這個濃度可以作為蘿卜轉基因種子的篩選濃度。

[1]孔秋生. 蘿卜種質資源遺傳多樣性和親緣關系研究 [D]. 武漢：華中農業大學, 2003.

[2]喻曉敏, 吳雷, 王魁, 等. 根癌農桿菌介導的蘿卜遺傳轉化方法研究[J]. 北方園藝, 2016(6)： 99-102.

[3]Kitashiba H, Li F, Hirakawa H,etal. Draft sequences of the radish (RaphanussativusL.) genome [J].DNAResearch, 2014, 21(5): 481-490.

[4]Kim N R,An G, Park M C. High -Frequency regeneration and transformation ofRaphanussativus[J].JournalofPlantBiology, 2001, 44(4): 231-235.

[5]李海萍, 張魯剛, 胥宇建, 等. 蘿卜遺傳轉化體系的建立[J]. 中國瓜菜, 2011, 24(4): 18-21.

[6]張廣輝, 鞏振輝, 薛萬新, 等. 大白菜和油菜真空滲入遺傳轉化法初報[J].西北農業大學學報, 1998，26(4):1-4.

[7]王道杰, 楊翠玲, 陸鳴. 真空滲透法轉化油菜及轉化種子的篩選[J]. 植物學報, 2009, 44 (2): 216-222.

[8]Wang W C, Menon G, Hansen G. Development of a novel Agrobacterium-mediated transformation method to recover transgenicBrassicanapusplants [J].PlantCellReports, 2003,22(4):274-281.

[9]鞏振輝, 何玉科. 擬南芥基因轉移新方法一真空滲入法的研究[J].西北植物學報, 1996，16(3):277-283.

[10]Chhikara S, Chaudhary D, Yadav M,etal. A non-tissue culture approach for developing transgenicBrassicajunceaL. plants with Agrobacterium tumefaciens [J].InVitroCellularandDevelopmentalBiology-Plant, 2012,48(1):7-14.

[11]Qing C M, Fan L, Lei Y,etal. Transformation of Pakchoi (BrassicarapaL.sspchinensis) by Agrobacterium infiltration [J].MolecularBreeding, 2000,6(1):67-72.

[12]趙靜. 大白菜遺傳轉化體系的優化[D].楊凌：西北農林科技大學，2016.

[13]王峰, 盧永恩, 李漢霞. 幾種白菜類蔬菜卡那霉素抗性的研究[J].武漢植物學研究, 2006，24(4):377-380.

[14]Curtis I S, Nam H G. Transgenic radish (RaphanussativusL. longipinnatus Bailey) by floral-dip method—plant development and surfactant are important in optimizing transformation efficiency [J]. Transgenic Research, 2001,10(4):363-371.

(編輯：馬榮博)

Effect of Kanamycin on the seed germination and seedling growth of radish (RaphnussativusL.)

Zhang Jing1, Li Haiping2

(1.CollegeofHorticulture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801，China; 2.CollegeofHorticulture,NorthwestAgricultureandForestryUniversity,Yangling712100，China)

[Objective]The best lethal concentration of kanamycin in radish seeds was screened.[Methods]The two radish inbred lines including 07Lb36-9 and07Lb39 were used as materials, the effect of different concentration of kanamycin on the seed germination and seedling growth of radish were studied.[Result]The result showed that the effect of kanamycin on the seed germination of different radish inbred lines were different. But the seedling growth was inhibited. The lethal rate became higher and the lengths of root and hypocotyl became shorter with the increase of the concentration of kanamycin. There was different kanamycin sensitivity of the two radish inbred lines. Therefore, the lethal concentration of kanamycin differed between the two radish inbred lines.[Conclusion]When the seeds were sowed on MS select medium after soaking by kanamycin solution, the lethal concentrations of 07Lb36-9 and 07Lb39 were 150 and 300 mg·L-1, respectively. These concentrations can be used as the screening concentration of the radish transgenic seeds.

Radish, Kanamycin, Sensitivity

2016-12-30

2017-06-13

張靜(1982-)，女(漢)，寧夏中衛人，講師，博士，研究方向：蔬菜育種與生物技術

山西農業大學科技創新基金(2014019)

S631

A

1671-8151(2017)09-0640-04