提高“DNA粗提與鑒定”實驗開出率的思考與探索

霍 靜

(西南大學生命科學學院/西南大學科學教育研究中心 重慶 400715)

李妞妞 曾令江

(西南大學生命科學學院 重慶 400715)

20世紀中后葉，分子生物學開發了一套人工操作DNA的技術，揭開了基因工程的序幕。目前，提取DNA已經有了較為成熟的方法，常用的有CTAB法、SDS法、鹽析法等[1]，甚至用一些特殊的方法還能獲得標本中“痕量級”DNA。中學學習DNA的提取，旨在結合學生已有知識，學會實驗研究的思路和方法。人教版教材就是利用“滲透吸水”和“鹽析”的原理，引導學生理解DNA提取的實驗設計。為了便于中學開出更具有操作性的DNA提取和鑒定的實驗，本文嘗試解析DNA粗提的實驗原理，并對實驗方法進一步改進，尋找一個適合在一節課中完成的實驗方案，為在中學更好地開設出該實驗提供理論和方法的指導。

1 實驗原理的解析

1．1 提取液的基本成分 從活細胞中獲取DNA，需要先構建一個細胞的立體圖景，才能更好的確定出實驗的基本思路，理解提取液的基本成分。細胞中的DNA大部分穩定地存在細胞核中，線粒體和葉綠體中也有少量的DNA存在，細胞核和細胞器懸浮于細胞質基質中，細胞質基質是一個酶溶液，各種復雜的代謝反應在這里有條不紊的進行。

1.1.1 緩沖體系的建立 目前研究已發現細胞質基質是一個高度有序的體系，其中蛋白質與蛋白質之間，蛋白質與其他大分子之間通過弱鍵而相互作用，并處于動態平衡之中，一旦細胞破裂，依靠分子間脆弱的相互作用而形成的結構體系就會遭到破壞。所以在實驗前，需要提供一個相對穩定的緩沖環境，使各種生物大分子基本維持其在細胞中的狀態。在提取DNA的研磨液中Tris-HCl就是一種溫和的緩沖液，它被廣泛用作核酸和蛋白質的溶劑。Tris堿性較強，中文名“三(羥甲基)氨基甲烷”，用HCl調配出來，就稱為Tris-HCl緩沖液。提取DNA的Tris-HCl緩沖液pH值為8，這種弱堿性溶液較好地維持了提取液的pH值，DNA被去質子化后，提高了DNA的溶解性。

1.1.2 DNA的核酸酶抑制劑 如果DNA離開了正常的生理位置，細胞質基質中的核酸酶會立即將其降解，以免干擾正常的生命活動。我們的汗液，唾液中也有大量的核酸酶，實驗使用的各種器具也會帶有核酸酶。在提取DNA之前，要盡可能先將這些核酸酶鈍化，保護好DNA。乙二胺四乙酸(EDTA)是一種金屬螯合劑，能螯合溶液中Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等二價金屬離子，而多數的核酸酶在發揮作用時需要Mg2+的參與，EDTA螯合了Mg2+，就能有效抑制核酸酶的活性。

1.1.3 DNA的溶解液 DNA在NaCl的鹽溶液中，隨著濃度的變化，溶解度也會發生變化。高濃度的NaCl(2 mol/L)溶液能溶解較多的DNA。同時，NaCl是一種中性鹽，高濃度的鹽溶液會破壞蛋白質的膠體性質，使其發生鹽析，形成沉淀。這樣就能在最初的提取環節，為DNA溶解和沉淀蛋白質做好準備。

1.1.4 在細胞膜上打洞 DNA包裹在細胞核的雙層膜結構中，整個細胞又由細胞膜包被。實驗要獲得游離的DNA，需要打開膜的束縛。而生物膜主要由磷脂和蛋白質組成，只要能破壞磷脂的結構，膜的基本骨架就會瓦解。十二烷基磺酸鈉(SDS)是一種離子型表面活性劑，對蛋白和油性污垢有較強的去除作用，在提取液中能有效破壞細胞膜的磷脂和膜蛋白，使細胞膜和核膜破裂。

在常用的洗滌劑中含有SDS的成分，所以洗滌劑具有較好地去除油漬的作用，但洗滌劑中不具備提取液中的其他成分，如果中學實驗只選用洗滌劑和食鹽的配比來研究DNA的粗提取，很難保證成功提取出DNA。

1．2 去除非DNA雜質 具體實驗步驟如下：

1.2.1 保留上清液 經過提取液處理的材料，理論上大部分的DNA已經溶解在提取液中，在實驗的體系中，還有大量不溶的物質，這些物質會干擾后面進一步從溶液中獲取DNA。

所以，需要保留上清液，去除其他的雜質?？尚械牟僮鞑襟E是離心取上清，如果中學沒有離心機，可以采用四層紗布過濾，收集提取液。

1.2.2 再次純化DNA DNA是由核苷酸高度聚合而成的一種非極性的生物大分子，結構穩定，不溶于極性的無水乙醇(酒精)。而不同種類的蛋白質，由于帶有不同數量的極性基團，乙醇就是很好的溶劑。純化DNA時，可以將收集到的上清液加入等體積或2倍體積的無水乙醇中，靜置2～3 min，白色的DNA就會呈絲狀沉淀出來。

1.3 鑒定DNA 在中學一般采用二苯胺試劑的顯色反應，較便捷地鑒定DNA。DNA在酸性條件下加熱，其嘌呤堿與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂，生成嘌呤堿、脫氧核糖和脫氧嘧啶核苷酸，其中的脫氧核糖在酸性環境中加熱脫水生成ω-羥基-γ-酮基戊醛，能與二苯胺試劑反應生成藍色物質，如果鑒定溶液顯淺藍色，就證明提取出了DNA。

2 實驗成功的關鍵問題思考

2.1 實驗材料的選取 人教版教材選修1《生物技術實踐》中通過基礎知識的梳理，整理出了鹽析提取DNA的實驗設計，在實驗材料選擇時提供了“魚卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動物的紅細胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養基中培養的大腸桿菌”作為材料的備選，并提示實驗可以比較哪種材料中的DNA含量更高。

如果以血液作為實驗材料，能方便的破碎細胞，但現有研究表明“哺乳動物的紅細胞一般是釋放到外周血中已經不含有細胞核的網織紅細胞，即便是非哺乳類動物的紅細胞也屬于高度特化的細胞種類”；選取洋蔥的肉質鱗片，這種變態葉是一種貯藏組織；香蕉、獼猴桃是已經成熟的果實；豌豆是種子；豬肝是高度特化的組織……這些材料內蛋白質或糖類等的含量較高，僅用粗提的實驗原理，很難較好地分離出DNA，在析出DNA的環節，會得到較多的非DNA的粘稠黃白色混合物，甚至無法用二苯胺試劑檢測到DNA的存在。

在實驗材料選擇時推薦DNA含量相對較高、蛋白質等雜質含量較少、顏色較淺的生物材料[2]。菜花容易在菜市購買到，在有溫室大棚蔬菜提供的城市也不受季節的影響，其中有大量的細胞在進行旺盛地分裂，細胞內DNA含量較高，其他生物大分子的含量不多，也沒有葉綠素的干擾，能通過研磨破碎細胞。培養的大腸桿菌也是提取DNA的好材料，在不具備培養大腸桿菌的實驗室，取材會受到限制。如果選用植物幼嫩的芽尖提取DNA，去除非DNA雜質時還需要加入氯仿等洗滌色素蛋白的步驟。所以，綜合考慮推薦中學選擇菜花作為實驗材料。

2.2 充分研磨 從實驗安全的角度考慮，不建議在液氮環境中研磨材料。根據中學的實際情況，在有提取液的條件下破碎細胞，才能更好地獲取細胞中的DNA。植物細胞被纖維質的細胞壁保護著，只有打開細胞壁才能讓細胞的內容物充分地流出，所以在實驗中充分研磨是必要的。在5 mL的提取液中，稱取2 g～5 g的材料(并不是材料越多越好)迅速研磨勻漿至肉眼看不見小顆粒。研磨過程要求盡可能快，保證細胞內含物能盡快與提取液混勻，避免DNA被降解。

2.3 避免加入與實驗無關的藥品 DNA提取要盡量避免蛋白質和DNA一起溶解在濾液中，嫩肉粉的主要成分為蛋白酶，它能將結構復雜的不溶于水的蛋白質大分子分解為能溶于水的小分子，增加了后期純化DNA 的難度。

而且，細胞中提取的DNA來源于由蛋白質參與盤曲折疊形成的高級結構——染色體，蛋白酶在分解蛋白質的時候，會破壞DNA的完整結構，導致無法獲得理想的DNA提取物。

3 可供參考的DNA粗提與鑒定方案

根據影響實驗成敗的因素分析，在實踐的基礎上，整理出適合在1節課完成的實驗操作步驟(表1，見后頁)，供中學生物學教師參考。

(基金項目：西南大學實驗技術研究項目，No.SYJ2016049)

表1用菜花提取DNA的實驗操作步驟

步驟方法操作時長(共35 min)研磨稱取剪好的菜花2～5 g于研缽中,加入5 mL研磨液,充分研磨至勻漿狀(研磨液:稱取1.01 g Tris試劑放入100 mL燒杯中,用50 mL蒸餾水溶解,再用2 mol/L的HCl將溶液酸堿性調到pH=8.0,即成為Tris-HCl緩沖液。然后再分別加入8.76 g NaCl、3.72 g EDTA(乙二胺四乙酸)、2 g SDS(十二烷基磺酸鈉),溶解后再加水定容到100 mL)2～5 min過濾在漏斗上墊四層用水潤濕的紗布,收集過濾研磨好的菜花濾液(若自然過濾速度過慢,可以戴上一次性手套擠壓;有條件的實驗室可采用3000 rmp、離心5～10 min的方法;若轉速更快,還可以縮短時間)2～5 min析出將濾液加入盛有兩倍體積冷凍無水乙醇的塑料離心管中,靜置。觀察白色絮狀物析出4～5 min5 min鑒定取A、B兩支試管,分別加入2 mL蒸餾水,用玻璃棒將白色絮狀物挑起放于B試管中,攪拌使其充分溶解;向兩支試管中各加入2 mL二苯胺試劑(現配現用)在沸水浴中加熱,觀察現象。15 min