用線粒體D-loop和Cyt b基因序列分析拉氏3個群體的遺傳結構和遺傳分化

楊培民，胡宗云，金廣海，劉義新，王雷，駱小年

（遼寧省淡水水產科學研究院，遼寧省水生動物病害防治重點實驗室，遼寧 遼陽 111000）

楊培民，胡宗云，金廣海，劉義新，王雷，駱小年

（遼寧省淡水水產科學研究院，遼寧省水生動物病害防治重點實驗室，遼寧 遼陽 111000）

用線粒體DNA的D-loop和Cyt b基因序列分析方法研究了吉林延吉、敦化和遼寧法臺3個區域的29尾拉氏Phoxinus lagowskii Dybowsky的遺傳多樣性。經PCR擴增和測序，獲得了783～785bp D-loop和818bp Cyt b的同源序列。兩者多態性遺傳參數統計顯示，29尾個體分別存在47（D-loop）和89（Cyt b）個變異位點，分別檢測出 15（D-loop）和 11（Cyt b）個單倍型，總群體單倍型（Hd）分別為 0.8966（D-loop）和 0.8990（Cyt b），核苷酸多樣性指數（P）i分別為0.0246（D-loop）和0.0498（Cyt b）,平均核苷酸差異數（K）分別為19.2857（D-loop）和40.7365（Cyt b）。分子方差分析（AMOVA）結果表明，79.02%（D-loop）和 81.69%（Cyt b）變異來自群體間，20.98%（D-loop）和18.31%（Cyt b）來自群體內。單倍型呈明顯的地理差異，分成2個分支，一個以延吉群體為主，一個以法臺群體為主。拉氏的遺傳多樣性水平較高，群體間遺傳分化明顯。該結果可為拉氏的種質資源保護提供參考。

拉氏；D-loop;Cyt b；遺傳多樣性；遺傳分化

線粒體DNA（mtDNA）具有母性遺傳、進化速度快、核苷酸替代率高的特點，是研究魚類進化生物學和群體遺傳的重要遺傳標記[11,12]。在mtDNA上，D-loop屬非編碼區，是整個mtDNA上進化速度最快的區域，常用于研究群體遺傳[12]。Cyt b基因是mtDNA上結構和功能解析最為透徹的蛋白質編碼基因之一，進化速度適中，適于檢測種群水平差異，亦用于研究種間和種內遺傳分化[13,14]。本研究對拉氏線粒體D-loop序列和Cyt b基因進行PCR擴增、測定和比對分析，旨在為了解東北地區3個拉氏野生群體遺傳多樣性水平和群體間遺傳分化程度，為保護拉氏資源提供遺傳背景依據。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年10月至2015年9月，采用地籠網采集了3個水系29尾野生拉氏樣本，其中敦化群體8尾（牡丹江水系，標記為DH）、延吉群體9尾（圖們江水系，標記為YJ）和法臺群體12尾（太子河水系，標記為 FT）。樣本體長為 9～16cm，體重為 11～42g。每尾剪取鰭條1～2g，保存于95%酒精內帶回實驗室。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、引物設計、PCR擴增及測序

取鰭條0.1g左右，利用天根生化科技有限公司的基因組提取試劑盒（DP304），按照試劑盒說明書提取總DNA。根據GeneBank中拉氏近緣種Phoxinus ujmonensis（NC_023802.1）、Phoxinus phoxinus（AB671170.1）和Rhynchocypris lagowski（iKJ641 843.1）提供的mtDNA全序列，通過比對獲得目的基因兩側的保守序列，利用Primer premier5.0軟件設計擴增D-loop和Cyt b序列的2對引物，由生工生物（上海）有限公司合成。D-loop引物為DF（5'-TTA GCGTGAAAGCATCGG-3'）和 DR（5'-GTGTAAGTTG GGTTAGAGC-3'）；Cyt b 引 物 為 CF（5'-CTAATG GCAAGCCTACGA-3'） 和 CR（5'-AGGATTTGCTGAGTGTAG-3'）。PCR 反應體系為 25μL：含 2.5μL 10×PCR buffer（Mg2+plus，20mM）、2μL dNTP mix（2.5mM）、0.25μL Taq DNA polymerase（5U/μL）、上下游引物各 1μL（10μM）、模板 1μL，雙蒸水補足至25μL。PCR擴增條件為：94℃預變性5min；35個循環，每個循環包括 94℃變性 1min，56℃退火1min，72℃延伸1min 30s；最后73延伸10min。本研究所有的PCR反應均在ABI 9700擴增儀上進行，擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得目的條帶的產物于-20℃冰箱內保存備用。PCR產物送至生工生物（上海）有限公司進行純化，并由ABI 3730全自動測序儀雙向測序，測序引物為上述PCR擴增引物。

1.2.2 數據處理

所測得的雙向序列利用DNAstar軟件（DNAS-tar，Inc）中的SeqMan程序進行拼接。運用MEGA6.0軟件包中的Alignment by ClustalW程序排列和比對拼接后的序列，輔以人工矯正；并運用該軟件包計算序列堿基組成、變異位點數和轉換與顛換值；利用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）基于 Kimura雙參數法（Kimura 2-parameter,K2p）模型構建系統進化樹，采用Bootstrap（1000個循環）檢驗節點的置信度。利用DnaSP（version 5.0）軟件統計單倍型、單倍型多樣性（h）、平均核苷酸差異數（K）及核苷酸多樣性（Pi）。應用Arequin 3.5軟件中的分子變異分析（AMOVA）方法計算遺傳分化指數（Fst），分析遺傳變異來源于組成。

2 結果與分析

2.1 D-loop和Cyt b基因片段的序列分析

表1 拉氏樣品來源信息Tab.1 The source information on samples of fat minnow Phoxinus lagowskii Dybowsky

表1 拉氏樣品來源信息Tab.1 The source information on samples of fat minnow Phoxinus lagowskii Dybowsky

群體敦化群體延吉群體法臺群體簡稱DH YJ FT所屬流域牡丹江圖們江太子河取樣時間2015.7 2014.10 2015.9采集地經緯度吉林省敦化市 N43°22′12.26″；E128°13′33.36″吉林省延吉市 N42°53′19.55″；E129°30′7.62″本溪市本溪縣法臺村N41°22′53.95″；E124°0′16.21″樣品數891 2

從3個群體29尾個體的D-loop和Cytb序列中，分別獲得了長度為783～785bp D-loop和818bp Cyt b的同源序列（表2）。在線粒體D-loop同源序列中檢測出47個變異位點，約占總位點的6%，其中簡約信息位點43個，單突變位點4個；發生堿基轉換的位點有30個，A/G轉換占66.75%，遠高于T/C轉換（23.36%）；顛換的位點有17個，A/T顛換比例最大（3.05%），A/C顛換次之（2.62%），G/C顛換最?。?.9%）；有2個插入/缺失位點，僅見于敦化群體（DH）。D-loop基因序列的 A、T、G、C 含量分別為30.2%、31.3%、15.8%和22.7%，A+T含量（61.5%）大于G+C含量（38.5%）。在獲得的818bp Cyt b同源序列中，變異位點89個，占總位點的10.88%，其中簡約信息位點87個，單突變位點2個；轉換數為80，其中T/C轉換占67.99%，A/G轉換較?。?6.07%）；顛換數為10，A/T顛換比例最大（3.05%），A/C顛換次之（2.62%），G/C顛換比例最?。?.9%），缺少堿基缺失 /插入位點；Cyt b基因片段中 A、T、G、C四種堿基含量分別為 25.3%、30.7%、15.8%和 28.2%，A+T含量（56%）大于G+C含量（44%）。D-loop和Cytb堿基組成呈較明顯的AT偏好和很強的反G偏歧。

2.2 拉氏3個群體的遺傳多樣性和遺傳結構分析

3個群體總體基于D-loop序列的單倍型多樣性、核苷酸多樣性和核苷酸差異數分別為0.8966、0.0247和19.2857；各群體的單倍型多樣性指數和核苷酸多樣性指數分別為 0.5758～0.9444和0.0014～0.0198；單倍型多樣性指數大小順序為YJ＞DH＞FT，而核苷酸多樣性指數的大小順序為DH＞YJ＞FT。3個群體總體的基于Cyt b基因片段單倍型多樣性、核苷酸多樣性和核苷酸差異數分別為0.8990、0.0498和40.7365；各群體的單倍型多樣性指數為0.4643～0.8611，YJ群體最高，FT群體次之，DH群體最??；核苷酸多樣性指數為0.0021～0.0401，各群體該指數的大小順序為DH＞YJ＞FT（表 2）。綜合 D-loop 和 Cyt b 序列的遺傳多樣性參數可知，3個拉氏群體總體的單倍型多樣性指數較高，除DH群體外，其余兩個群體的核苷酸多樣性指數均處于較低水平。

用 Kimura雙參數法（Kimura 2-parameter，K2p）計算3個群體間遺傳距離和遺傳分化指數（表3）?；贒-loop序列的計算結果表明，3個群體的群體內遺傳距離分別為 0.001～0.020，大小順序為DH＞YJ＞FT；群體間遺傳距離為 0.016～0.049，YJ與FT群體間距離最大，YJ與DH群體間次之，DH與FT群體間最小?；贑yt b序列的分析結果顯示：YJ與FT群體的群體內遺傳距離相等且較小，僅為0.002，小于DH群體的群體內遺傳距離（0.044）；3個群體的群體間遺傳距離為0.035～0.109，兩兩群體間遺傳距離大小順序與基于D-loop序列一致。遺傳分化分析表明，基于D-loop和Cyt b序列的群體間遺傳分化指數分別為0.3859～0.9569和0.4167～0.9786，遺傳分化指數均大于0.25，達極顯著水平（P＜0.01），表明群體間分化顯著。

表2 拉氏3個群體D-loop和Cyt b基因的遺傳多樣性參數Tab.2 Geneticdiversityparameters of D-loopandCyt b genes in three population soffatminnow Phoxinuslagowskii Dybowsky

表2 拉氏3個群體D-loop和Cyt b基因的遺傳多樣性參數Tab.2 Geneticdiversityparameters of D-loopandCyt b genes in three population soffatminnow Phoxinuslagowskii Dybowsky

注：*P＜0.05

D-loop Cyt b遺傳多樣性參數個體/個序列長度/bp變異位點/個轉換/顛換/個插入/缺失數/個單倍型數/個單倍型多樣性指數核苷酸多樣性指數平均核苷酸差異數Fu'Fs P值DH 8 783-785 37 20/17 YJ 9 784 7 7/0 FT 12 785 5 5/0 DH 8 818 77 68/9 YJ 9 818 7 4/1 FT 12 818 5 5/0 24 07 05 03 05 04 0.6428 0.0198 15.50 5.9492 0.9890 0.9444 0.0030 1.1061-3.2237*0.0410 0.5758 0.0014 2.3889-1.6451*0.0100總體29 785 47 30/17 2 15 0.8966 0.0247 19.2857 2.6923 0.8740 0.4643 0.0401 32.8214 12.2515 1.0000 0.8611 0.0021 1.7778-1.1130 0.1340 0.7121 0.0020 1.6970 0.5384 0.6460總體29 818 89 80/10 0 11 0.8990 0.0498 40.7365 14.5097 0.9990

由表4可知，方差剖分顯示遺傳變異主要源于群體間，基于D-loop和Cyt b的方差組分為79.02%和81.69%。把3個群體歸為一個整體時，總的遺傳分化為 0.7902（D-loop）和 0.8169（Cyt b），二者的P=0.0000，表明群體間已出現顯著分化。

表3 拉氏3個群體D-loop和Cyt b基因群體間/群體內的Kimura2-parameter遺傳距離及遺傳分化Tab.3 The genetic distance and genetic differentiation of Kimura2-parameter by D-loop and Cyt b genes among and within populations of fat minnow Phoxinus lagowskii Dybowsky

表3 拉氏3個群體D-loop和Cyt b基因群體間/群體內的Kimura2-parameter遺傳距離及遺傳分化Tab.3 The genetic distance and genetic differentiation of Kimura2-parameter by D-loop and Cyt b genes among and within populations of fat minnow Phoxinus lagowskii Dybowsky

注：左下角為群體間遺傳距離；對角線上為群體內遺傳距離；右上角為群體間遺傳分化；*P＜0.01

群體DH D-loop YJ FT DH Cyt b YJ FT FT 0.3859*0.9569*0.001 0.4167*0.9786*0.002 DH 0.020 0.038 0.016 0.044 0.078 0.035 YJ 0.6967*0.003 0.049 0.7159*0.002 0.109

2.3 單倍型分布與聚類分析

D-loop和Cyt b測序結果經比對分別定義了15和11個單倍型（表5）。在D-Loop序列的單倍型中，除Hap2為DH和YJ共享外，其余單倍型為各群體特有；各群體中不同單倍型的比例顯示，DH、YJ和FT群體的優勢單倍型分別為 Hap1、Hap2（Hap10）和Hap6。在Cyt b的單倍型中，除Hap3為YJ和DH共享外，其余單倍型為各群體特有；DH、YJ和FT群體的優勢單倍型分別為Hap1、Hap9和Hap7。

基于K2p算法，D-loop序列的15個單倍型間遺傳距離為0.001～0.053，總體平均遺傳距離為0.028；Cyt b序列的 11個單倍型間遺傳距離為0.001～0.111，總體平均遺產距離為0.061。用鄰接法構建的進化樹的聚類結果顯示，基于D-loop和Cyt b的單倍型，進化樹分為2個分支：1個分支以延吉群體為主，另1個以法臺群體為主，而敦化群體的單倍型在兩個分支上均有分布（圖1和圖2）。

表4 拉氏3個群體D-loop和Cyt b基因的AMOVA分析Tab.4 The AMOVA analysis of D-loop and Cyt b genes in three populations of fat minnow Phoxinus lagowskii Dybowsky

表4 拉氏3個群體D-loop和Cyt b基因的AMOVA分析Tab.4 The AMOVA analysis of D-loop and Cyt b genes in three populations of fat minnow Phoxinus lagowskii Dybowsky

變異來源群體間群體內總體固定指數自由度2 26 28 D-loop Cyt b平方和207.702 73.264 280.966方差組分10.6158 2.8178 13.4336方差比例/%79.02 20.98自由度2 26 28平方和438.991 131.319 570.310方差組分22.5322 5.0508 27.5830 0.7902(P=0.0000) 0.8169(P=0.0000)方差比例/%81.69 18.31

表5 拉氏3個群體單倍型數目、類型、頻率及分布Tab.5 The haplotype number,type,frequency and distribution in three populations of fat minnow Phoxinus lagowskii Dybowsky

表5 拉氏3個群體單倍型數目、類型、頻率及分布Tab.5 The haplotype number,type,frequency and distribution in three populations of fat minnow Phoxinus lagowskii Dybowsky

D-loop Cyt b單倍型FT(12)YJ(9)FT(12)Hap1 Hap2 Hap3 Hap4 Hap5 Hap6 Hap7 Hap8 Hap9 Hap10 Hap11 Hap12 Hap13 Hap14 Hap15 DH(8)5(62.5%)1(12.5%)1(12.5%)1(12.5%)YJ(9)0 2(22.2%)0000 DH(8)6(75%)1(12.5%)1(12.5%)00 2(22.22%)000 00000000000 0000000 1(8.33%)8(66.67%)1(8.33%)1(8.33%)1(8.33%)0000 2(16.67%)1(8.33%)3(25%)6(50%)2(22.22%)1(11.11%)1(11.11%)1(11.11%)1(11.11%)1(11.11%)000000單倍型總數5(17.24%)3(10.34%)1(3.45%)1(3.45%)1(3.45%)8(27.59%)1(3.45%)1(3.45%)1(3.45%)2(6.90%)1(3.45%)1(3.45%)1(3.45%)1(3.45%)1(3.45%)00000000----1(11.11%)3(33.33%)1(11.11%)2(22.22%)單倍型總數6(20.69%)1(3.45%)3(10.34%)2(6.90%)1(3.45%)3(10.34%)6(20.69%)1(3.45%)3(10.34%)1(3.45%)2(6.90%)----0000--------

圖1 拉氏mtDNA控制區單倍型NJ樹Fig.1 The NJ tree of haplotypes in mtDNA control region in fat minnow Phoxinus lagowskii Dybowsky

圖2 拉氏mtDNA Cyt b單倍型NJ樹Fig.2 The NJ tree of haplotypes in mtDNA Cyt b in fat minnow Phoxinus lagowskii Dybowsky

3 討論

3.1 拉氏D-loop和Cyt b序列堿基組成

本研究獲得的D-loop和Cyt b基因同源片段序列中，堿基組成的分布較為一致：T含量最高，G含量最低；A+T含量高于G+C含量。這與其他魚類線粒體DNA堿基組成相同[15-18]，符合動物線粒體基因組中4種核苷酸不均一分布這一共性[19]。測得的D-loop序列含有2個插入/缺失位點，而Cyt b中沒有發現插入/缺失位點，這是因為D-loop序列為非編碼基因，不受蛋白功能需要和三聯體密碼限制，插入/缺失位點突變后比較容易保留；而Cyt b用于編碼蛋白質，帶有插入/缺失突變的個體很容易被淘汰[19]。

3.2 群體遺傳多樣性

遺傳多樣性不僅是形成生物多樣性的基礎，也是物種進化潛能的保證[20]。一般來說，物種遺傳多樣性與其適應能力、生存能力和進化潛力密切相關，遺傳變異是有機體適應環境的必要條件[21,22]。單倍型多樣性（h）和核苷酸多樣性（π）是衡量物種或種群線粒體DNA變異程度的2個重要指標[23]。根據 Grant和 Bowen[24]的分類，以 h=0.5、π=0.005 為界，本研究中的YJ和FT群體屬高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性類型。此類型種群通常由一個較小的有效種群經過近期快速擴張形成一個大的種群引起。這種快速群體擴張可產生許多新的突變，積累了單倍型的多樣性，但缺乏足夠時間積累核苷酸序列的多樣化[24]。與YJ和FT群體不同，DH群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性較高，這種高h高π的遺傳多樣性模式通常是由一個較小的有效種群長期快速增長成一個大的種群所引起[24]。D-loop序列的Fu’Fs中性檢驗表明，YJ和FT群體發生了群體擴張事件，而DH群體未經歷群體擴張；而Cyt b基因序列的Fu’Fs中性檢驗結果表明：3個群體未經歷群體擴張事件，其原因有待進一步研究。雖然YJ和FT群體的核苷酸多樣性指數較低，但拉氏樣本種群整體核苷酸多樣性指數較高，其原因可能是不同地理環境對拉氏種群的影響不同；兩地拉氏核苷酸多樣性指數較低，預示著捕食、污染或水利建設等因素已影響了種群規?；謴?，種質資源保護工作亟待加強。

3.3 種群遺傳分化

遺傳分化指數（Fst）是衡量群體間遺傳分化的重要指標，Fst接近于0時，表明群體間沒有發生遺傳分化，在0到1范圍內其值越大，兩種群的分化程度越高[25]。根據 Balloux等[26]的界定，Fst為0～0.05表示極小遺傳分化；Fst為 0.05～0.15表示中度遺傳分化；Fst為0.15～0.25表示較大遺傳分化；Fst大于0.25，表示有極大的遺傳分化。本研究中兩兩群體相比較的Fst和P值檢驗顯示，線粒體D-loop和Cyt b兩個序列均檢測到兩兩群體間極大的遺傳分化，尤其是YJ和FT群體間Fst達到了0.9569（D-loop）和 0.9786（Cyt b）接近于 1，表明兩群體間幾乎不存在基因交流，為相對獨立的兩個群體。AMOVA分析結果顯示，3個群體作為1個總體的遺傳分化指數達到0.7902（D-loop）和0.8169（Cyt b），表明這一總群體存在極大遺傳分化；79.02%（D-loop）和81.69%（Cyt b）的群體間遺傳變異在總體遺傳變異中占有較大比例，表明3個群體間遺傳差異較大。單倍型聚類分析也支持上述觀點，3個群體均有自己獨有的單倍型，DH與YJ兩群體存在共享單倍型，這些單倍型聚類分成兩個類群：一個以YJ群體為主，一個以FT群體為主，DH群體單倍型在兩個類群中均有分布。

遺傳距離表明種群之間親緣關系，可以對種群之間的遺傳關系做出預測[27]。本研究中3個拉氏群 體 間 遺 傳 距 離 為 0.016～0.049 （D-loop）和0.035～0.109（Cyt b）。雖然兩個基因片段得到的群體間遺傳距離存在差異，但都反映了FT和DH群體遺傳距離最小及FT和YJ群體遺傳距離最大；這與FT和YJ群體相距最遠及DH和YJ群體相距最近的地理分布并不相符。筆者認為，原因可能是FT群體距本溪市（拉氏主要銷售和批發市場）最近，敦化產的拉氏有很大比例運往該地銷售，人為促進了兩地拉氏的基因交流；而延吉地區拉氏產量和消費量較低，很少外運銷售，該地區拉氏群體處于相對“封閉”狀態。

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Genetic Diversity and Differentiation of 3 Geographic Populations of Fat Minnow Phoxinus lagowskii Dybowsky Revealed by D-loop and Cyt b Gene Analyses

YANG Pei-min,HU Zong-yun,JIN Guang-hai,LIU Yi-xin,WANG Lei,LUO Xiao-nian
（Liaoning Key Laboratory for Prevention and Treatment of Aquatic Animal Diseases,Freshwater Fisheries Research Academy of Liaoning Province,Liaoyang 111000,China）

The genetic diversity and differentiation of fat minnow Phoxinus lagowskii Dybowsky were studied based on the sequences analysis of mtDNA（D-loop and Cyt b）in 29 individuals from 3 geographical populations including Dunhua（n=8）,Yanji（n=9）and Fatai（n=12）.Using PCR amplification and sequencing,783～785 bp of D-loop,which had polymorphic site number of 47,haplotype number of 15,haplotype diversity of 0.8966,nucleotide diversity of 0.0246,and average nucleotide difference of 19.2857,and 818 bp of Cyt b sequences,which had polymorphic site number of was 89,haplotype number of of 11,haplotype diversity of 0.8990,nucleotide diversity of 0.0498,and average nucleotide difference of 40.7365,were obtained.AMOVA revealed there was higher percentage variation of 79.02%among-population than that of 20.98%within-population in D-loop sequences.Similarly,the variation percentage of 81.69%was observed among-population,higher than that of 18.31%within-population in Cyt b sequences.The haplotype distribution was characterized by geographical differentiation,with two main branches of haplotypes,one from Yanjin population,and the other from Fatai population.There were high genetic diversity and the genetic differentiation between populations of fat minnow.The findings may be very useful to protect this species stock.

Phoxinus lagowskii;D-loop;Cyt b;genetic diversity;genetic divergence

S917

A

1005-3832（2017）04-0007-06

2017-03-30

遼寧省科學事業公益研究基金（2014002015）.

楊培民（1979-），男,副研究員，從事水產動物繁殖與遺傳育種研究.E-mail:pmyang313@163.com