川芎嗪對人肝癌細胞TGF- β1/Smads通路的影響

李克躍，石承先，湯可立，魏國微，張帥民，徐閑剛，劉振華，黎濤

(貴州省人民醫院 肝膽外科，貴州 貴陽 550002)

川芎嗪對人肝癌細胞TGF- β1/Smads通路的影響

李克躍，石承先，湯可立，魏國微，張帥民，徐閑剛，劉振華，黎濤

(貴州省人民醫院 肝膽外科，貴州 貴陽 550002)

目的：研究川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)對人肝癌細胞TGF- β1/Smads通路的影響，以探討其抑制肝癌的原因。方法：將人肝癌細胞分為4個組，即對照組和不同質量濃度的TMP組(0.04、0.2、1.0 mg·ml-1)，各組給予對應藥物干預24 h，CCK- 8細胞計數法測定細胞增殖水平的變化，real- time PCR方法檢測各組肝癌細胞TGF- β1、Smad4及Smad7 mRNA表達，Western blotting方法檢測各組細胞TGF- β1及Smad4蛋白表達。結果：在TMP干預24 h后，肝癌細胞的增殖明顯受到抑制，肝癌細胞TGF- β1及Smad7的mRNA及蛋白表達明顯下調，而Smad4的mRNA及蛋白表達明顯上調(均P<0.05)，呈現濃度依賴性。結論：TMP的抗肝癌作用可能與它對肝癌細胞TGF- β1/Smads通路的調控有關。

肝癌； TGF- β1/Smads； 川芎嗪

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床常見的惡性腫瘤，全世界每年有將近600 000患者死于肝細胞癌[1]。手術切除是唯一可能治愈肝細胞癌的手段，但是肝細胞癌患者術后5年生存率僅為30%～40%[2]，其原因是肝細胞癌具有較高的復發和轉移率。轉化生長因子β1(transforming growth factor- β1，TGF- β1)在肝癌組織中明顯高表達，已被用于判斷肝癌惡性程度及預后[3- 5]。TGF- β1主要通過TGF- β1/Smads信號轉導通路發揮生物學作用，該通路在肝癌的形成、進展及轉移等過程中發揮了重要作用[6- 7]。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是中藥川芎提取的單體，有一定的抗肝癌作用[8- 10]，具有副作用小等特點，其抗肝癌的機制未徹底闡明，對HCC中TGF- β1/Smads信號轉導通路的作用也不清楚。本研究對體外培養的人肝癌細胞使用不同質量濃度的川芎嗪干預，觀察它們對細胞增殖及TGF- β1、Smad4、Smad7 mRNA和蛋白表達的影響，為合理應用川芎嗪治療HCC提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

Hep 3B人肝癌細胞系購買于中國科學院典型培養物保藏中心；胎牛血清(Gibco公司)；DMEM、0.25%胰蛋白酶及青霉素-鏈霉素溶液(Hyclone公司)；SYBRR Premix Ex TaqTM實時PCR試劑盒(RP820A，TaKaRa公司)；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒(上海生工生物有限公司)；TGF- β1上游引物序列5′- ACAATTCCTGGCGATACCTC- 3′，下游引物序列5′- TAAGGCGAAAGCCCTCAAT- 3′;Smad4上游引物序列5′- ACGAACGAGTTGTATCACCTGG- 3′，下游引物序列5′- TGCACGATTACTTGGTGGATG- 3′;Smad7上游引物序列5′- GGACGCTGTTGGTACACAAG- 3′，下游引物序列5′- GCTGCATAAACTCGTGGTCATTG- 3′；GAPDH上游引物序列5′- TGACTTCAACAGCGACACCCA- 3′，下游引物序列5′- CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA- 3′(引物由Introgen公司合成)；抗TGF- β1抗體(ab92486)、抗Smad4抗體(ab40759)(Abcam公司)；抗β- actin抗體、山羊抗兔lgG- HRP(北京全是金生物技術有限公司)。注射用鹽酸川芎嗪(北京四環科寶制藥有限公司，批號14032015)用DMEM培養液溶解為指定的質量濃度，0.22m濾器除菌，臨用時配制。

1.2 細胞培養

采用6孔板培養實驗所用細胞，用含5%FBS的完全培養基2 ml培養，細胞密度為(4～5)×104孔-1，培養箱條件為37 ℃、體積分數5%的CO2。1～2 d換培養液1次，2～4 d細胞布滿瓶底后用胰酶消化傳代，所用細胞為8～10代。

1.3 細胞分組及其處理

細胞總共分為4個組，即對照組和肝癌細胞+不同質量濃度的TMP(0.04、0.2、1.0 mg·ml-1)組。待細胞生長到50%左右后使用無血清的DMEM饑餓過夜，次日各組細胞加入含有上述不同組別藥物的培養基培養24 h。

1.4 觀察指標

1.4.1 細胞增殖水平的測定 采用CCK- 8法。轉移細胞至96孔板，將細胞濃度調整為5×104ml-1，每孔100 μl，做5個復孔，細胞培養條件為37 ℃、體積分數5%的CO2。細胞經饑餓過夜后加入上述對應質量濃度藥物分別培養24 h，然后每孔加入CCK- 8試劑10 μl培養2.5 h，在酶標儀450 nm波長處測定各組細胞的光密度值(OD值)，采用扣除本底的策略來消除誤差。

1.4.2 細胞TGF- β1、Smad4及Smad7 mRNA的表達 采用real- time PCR方法檢測。各組細胞分別提取RNA，選擇完整性高、純度好的RNA進行cDNA的合成。real- time PCR反應體系為20 μl，其中2×SYBRRPremix 10 μl，上下游引物各0.4 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 7.2 μl。反應條件為95 ℃預熱30 s后進行40個循環，循環的條件為95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s。以GAPDH作為內參測定目的基因的相對表達量，以2-ΔΔct法計算目的基因的相對表達量。

1.4.3 細胞TGF- β1及Smad4蛋白的表達 使用Western blotting方法檢測。將各組細胞分別提取總蛋白后通過BCA法測定蛋白濃度，將蛋白配平后放置于聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，進行PVDF轉膜后以足量的封閉液給予封閉，按1∶5 000比例稀釋目的蛋白的一抗，在4 ℃冰箱內孵育過夜?；厥找豢购笠宰懔康腡BST在搖床上洗PVDF膜3次，每次10 min。按1∶5 000比例稀釋二抗后在室溫下振蕩孵育2 h，倒掉二抗孵育液后以足量的TBST清洗PVDF膜3次，每次10 min。電化學發光后用顯影和定影方法對膠片進行拍照及掃描，以β- actin蛋白為內參蛋白，用Quantity one系統分析目的條帶的相對灰度值。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 不同質量濃度的TMP對人肝癌細胞增殖水平的影響

使用不同質量濃度的TMP干預后，肝癌細胞的增殖明顯受到抑制(0.489±0.011vs0.516±0.005，P=0.001；0.460±0.006vs0.516±0.005，P=0.000；0.405±0.014vs0.516±0.005，P=0.000)，呈現濃度依賴性。

2.2 不同質量濃度的TMP對人肝癌細胞TGF- β1、Smad4及Smad7 mRNA表達的影響

使用不同質量濃度的TMP干預后，人肝癌細胞的TGF- β1(0.937±0.025vs1.000±0.088，P=0.808；0.875±0.045vs1.000±0.088，P=0.044；0.634±0.041vs1.000±0.088，P=0.000)及Smad7(0.944±0.032vs1.000±0.019，P=0.114；0.840±0.036vs1.000±0.019，P=0.000；0.767±0.026vs1.000±0.019，P=0.000)mRNA表達明顯下調，Smad4(0.738±0.037vs0.656±0.042，P=0.073；0.869±0.020vs0.656±0.042，P=0.000；1.000±0.053vs0.656±0.042，P=0.000)mRNA的表達明顯上調，呈現濃度依賴性。

2.3 不同質量濃度的TMP對人肝癌細胞TGF- β1及Smad4蛋白表達的影響

使用不同質量濃度的TMP干預后，肝癌細胞的TGF- β1(0.931±0.013vs1.000±0.092，P=0.512；0.855±0.037vs1.000±0.092，P=0.012；0.734±0.031vs1.000±0.092，P=0.000)蛋白表達明顯下調，而Smad4(0.787±0.019vs0.735±0.024，P=0.053；0.876±0.023vs0.735±0.024，P=0.000；1.000±0.029vs0.735±0.024，P=0.000)蛋白表達明顯上調，與mRNA表達變化趨勢一致，呈現明顯的濃度依賴性，見圖1。

圖1 不同質量濃度的川芎嗪對人肝癌細胞TGF- β1及Smad4蛋白表達的影響

Fig 1 Effects of different concentration of TMP on proteins expression of TGF- β1 and Smad4

3 討 論

TGF- β1在調節細胞的增殖、分化以及凋亡等過程中發揮了重要作用，在肝癌細胞中表達明顯增高[3,11]。TGF- β1在肝癌的發生過程中起雙向調節作用，即在肝癌形成早期抑制腫瘤的生長，在肝癌進展期則促進腫瘤的生長[12- 14]。TGF- β1主要是通過與其受體TβRⅠ、TβRⅡ及TβRⅢ形成復合物后調控Smad2/Smad3、Smad4、Smad6/Smad7等蛋白，形成TGF- β1/Smads信號轉導通路發揮生物學作用，在該通路中Smad4是通用Smad(Co- Smad)，Smad2/Smad3是受體Smad(R- Smad)，Smad6/Smad7是抑制Smad(I- Smad)[14]。在肝細胞肝癌組織中TGF- β1及Smad7的表達明顯上調，而Smad4的表達明顯下調，提示TGF- β1/Smads信號傳導通路在肝癌的形成、進展及轉移等過程中可能發揮了重要作用[4,11]。研究表明，Smad4可能通過誘導腫瘤細胞凋亡、降低癌細胞中VEGF的表達、與其它細胞外基質或信號通路相互作用等途徑抑制腫瘤生長[15- 17]。肝癌組織中TGF- β1的過高表達可能是由肝癌細胞的自分泌及旁分泌產生的[18- 19]。TGF- β1/Smads信號傳導通路在肝癌的形成、進展及轉移等過程中發揮了重要作用。因此，調控TGF- β1/Smads通路的表達已經成為了治療肝癌的主要手段之一[7,20]。

川芎嗪是中藥川芎的提取單體，具有抗組織纖維化、抗氧自由基、改變血液流變學、免疫抗腫瘤等功效，副作用較小，其抗肝癌機制可能與誘導肝癌細胞的凋亡及自噬等因素有關[9]，也有可能與其調控Bax、Bcl- 2基因的表達從而調控細胞的凋亡及增殖周期有關[8]，還有可能與其調控肝癌細胞中MDR1、MRP2、MRP3、MRP5、P- gp170基因的表達[10,21]及NF- κB/p65、COX- 2的表達有關[22]。本實驗結果提示,川芎嗪抑制體外培養的HCC細胞增殖，下調TGF- β1及Smad7的mRNA及蛋白表達，同時上調Smad4的mRNA及蛋白表達，提示川芎嗪的抗肝癌機制之一可能與其對該細胞中TGF- β1/Smads通路進行調控有關。

綜上所述，TMP的抗肝癌作用可能與它對肝癌細胞TGF- β1/Smads通路的調控有關。

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Effect of tetramethylpyrazine on TGF- β1/Smads signaling pathway in hepatocellular carcinoma

LI Ke- yue,SHI Cheng- xian,TANG Ke- li,WEI Guo- wei,ZHANG Shuai- min,XU Xian- gang,LIU Zhen- hua,LI Tao

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,GuizhouProvincialPeople’sHospital,Guiyang550002，China)

Objective: To investigate tetramethylpyrazine(TMP) effects on transforming growth factor- β1 (TGF- β1)/Smads signaling pathway in hepatocellular carcinoma (HCC). Methods: HCC cells were divided into four groups:control group, different concentration of TMP(0.04，0.2 and 1.0 mg·ml-1). After respectively incubated with 24 h, cells proliferation was investigated by CCK- 8, Relative mRNA expression of TGF- β1, Smad4 and Smad7 in HCC were assessed by real- time PCR. Relative proteins expression of TGF- β1 and Smad4 were investigated by Western blotting. Results: TMP significantly attenuated cells proliferation, significantly down- regulated both the mRNA and protein expression of TGF- β1 and Smad7, significantly up- regulated the mRNA and protein expression of Smad4 (allP<0.05). Conclusion: TMP effects anti- HCC possibly through modulating TGF- β1/Smads signaling pathway.

hepatocellular carcinoma; TGF- β1/Smads; tetramethylpyrazine

2016- 11- 17

2017- 04- 26

貴州省中醫藥、民族醫藥科學技術研究課題資助(GZYY- 2015- 002)

李克躍(1978-)，男，貴州貴陽人，副主任醫師，醫學博士。E- mail:keyuelee@sohu.com

李克躍,石承先,湯可立,等.川芎嗪對人肝癌細胞TGF- β1/Smads通路的影響[J].東南大學學報：醫學版，2017，36(4)：554- 558.

R282.710.7; R735.7

A

1671- 6264(2017)04- 0554- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.04.011