大黃素通過影響AQP3表達水平改善急性重癥胰腺炎大鼠的器官功能

陳鋒，趙煜，熊偉

(四川省人民醫院1.急診科，2.急診外科，3.肝膽外科，四川 成都 610072)

大黃素通過影響AQP3表達水平改善急性重癥胰腺炎大鼠的器官功能

陳鋒1，趙煜2，熊偉3

(四川省人民醫院1.急診科，2.急診外科，3.肝膽外科，四川 成都 610072)

目的：探討大黃素對急性重癥胰腺炎(SAP)大鼠器官功能及水通道蛋白3(AQP3)信號通路的影響。方法：將72只大鼠隨機分為假手術組(Sham組,24只)、模型組(Model組,24只)和大黃素組(Emodin組,24只)。Model組和Emodin組通過胰管內注射牛黃膽酸鈉的方法建立SAP大鼠模型，Sham組僅向胰管內注射等量生理鹽水。Emodin組采用大黃素灌胃，Sham、Model組給予等量生理鹽水。造模后24、48、72 h每組分別處死8只大鼠，取其組織，石蠟包埋切片后經蘇木精-伊紅(HE)染色后光鏡下觀察大鼠胰腺、肝臟、肺臟組織病理改變，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組大鼠血清腫瘤壞死因子- α(TNF- α)、白細胞介素- 6(IL- 6)水平含量，氯化硝基苯- α- 半乳糖麥芽糖苷法檢測血清淀粉酶(Amy)的含量，蛋白質免疫印跡法(Western blotting)檢測回腸中AQP3蛋白表達，實時熒光定量PCR(RT- qPCR)檢測回腸中AQP3的mRNA表達。結果：Sham組不同時間點胰腺、肝臟、肺臟病理評分均顯著低于Emodin組和Model組(均P<0.05)，Emodin組不同時間點胰腺、肝臟、肺臟病理評分均顯著低于Model組(均P<0.05)。Sham組不同時間點血清Amy、TNF- α、IL- 6水平均顯著低于Emodin組和Model組(均P<0.05)，Emodin組不同時間點血清Amy、TNF- α、IL- 6水平均顯著低于Model組(均P<0.05)。Sham組回腸中不同時間點AQP3蛋白及mRNA表達均顯著低于Emodin組和Model組(均P<0.05)，Emodin組回腸中不同時間點AQP3蛋白及mRNA表達均顯著低于Model組(均P<0.05)。結論：SAP病理改變與AQP3異常表達有關；大黃素能夠保護SAP的器官功能，降低炎癥因子釋放，其作用機制可能與下調AQP3表達、降低腸黏膜通透性有關。

大黃素； 急性重癥胰腺炎； 水通道蛋白3； 炎癥細胞因子； 大鼠

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)發病與全身炎癥反應有關。SAP常累及全身多器官，導致多器官功能衰竭或全身感染，這亦是SAP死亡的主要原因[1]。國外研究[2]顯示,在胰腺炎早期單核細胞、巨噬細胞及中性粒細胞等釋放多種細胞因子，當血液循環中細胞因子水平升高會進一步誘導全身嚴重反應及多器官功能障礙綜合征?；A研究[3]證實，SAP急性反應期器官功能衰竭的病理基礎是腸黏膜通透性增高，毛細血管滲漏而引起體液丟失。水通道蛋白3(aquaporin 3，AQP3)是存在于消化系統上皮細胞的一種轉化蛋白，其表達水平與甘油、水等小分子物質的通透性有關[4]。在病理情況下，AQP3表達異常，導致腸黏膜通透性增加，黏膜屏障受損。大黃素(emodin)是從大黃中提取的蒽醌類衍生物。體外研究[5]證實,大黃素具有導瀉、抑菌、利尿等作用，能夠改善SAP患者臨床癥狀，但是大黃素對SAP的具體作用機制尚不清楚。本研究對SAP大鼠采用大黃素灌胃治療，觀察大鼠器官功能及AQP3表達水平，旨在探討大黃素治療SAP的作用機制，現將研究結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

本實驗大鼠處置方法經過本院動物倫理學委員會批準，選擇72只SPF級健康SD大鼠，雌雄各半，6～8周齡，體質量220～300 g，平均(245±34)g，均購自四川省華西醫院實驗動物中心，動物合格證號為SCXK- 2015- 009。按照隨機數字表法將72只大鼠分為假手術組(Sham組,24只)、模型組(Model組,24只)和大黃素組(Emodin組,24只)；Sham、Model、Emodin組3組大鼠的周齡、體質量比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 主要儀器與試劑

?；悄懰徕c購自上海一研生物科技有限公司(純度>95%)；大黃素購自臺州海辰藥業有限公司；淀粉酶(amylase，Amy)定量測定試劑盒購自保定長城臨床試劑有限公司；腫瘤壞死因子- α(tumor necrosis factor，TNF- α)、白細胞介素- 6(interleukin- 6，IL- 6)購自上?；馍锛夹g有限公司；兔抗鼠AQP3多克隆抗體購自Sigma公司；免疫組化試劑盒、3,3′- 二氨基聯苯胺(DAB)、Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司；甘油醛- 3- 磷酸脫氫酶(glyceraldehyde- 3- phosphate dehydrogenase，GAPDH)、辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國Santa Cruz公司；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS)、RPMI 1640培養基購自武漢博士德生物工程有限公司。AU5800全自動生化分析儀購自貝克曼庫爾特公司；GeneAmp 9700 PCR儀購自美國ABI公司；TS100- F倒置顯微鏡購自尼康公司；Odyssey成像系統及圖像分析軟件購自美國LI- COR公司。

1.3 方法

1.3.1 大鼠SAP模型的建立 參考Abe等[6]報道，大鼠術前24 h禁食，自由飲水，3%戊巴比妥鈉按1 ml·kg-1腹腔注射麻醉；于上腹正中作長約2 cm切口，注射針頭經十二指腸漿肌層行膽胰管穿刺術，穿刺成功后用無創傷血管鉗夾住膽胰管近肝端及十二指腸穿刺處，向胰管內均勻注射5%的牛黃膽酸鈉(1 ml·kg-1)，注射后觀察5～10 min，去除血管鉗，確認腹腔無活動性出血后關腹。Sham組僅向胰管內注射等量生理鹽水;Emodin組采用大黃素灌胃，20 mg·kg-1，每日灌胃1次，連續灌胃3 d；Sham、Model組給予等量生理鹽水，方法及給藥時間同Emodin組。各組造模成功后分別于造模后24、48、72 h分別處死8只大鼠，處死后從心臟取血置于肝素抗凝管中，-20 ℃保存待檢。再分別取米粒大小的回腸、胰腺、肝臟、肺臟組織，5%多聚甲醛固定，液氮保存待檢。

1.3.2 組織形態學的觀察 將不同時段的胰腺、肝臟、肺臟組織樣本從液氮中取出，置于10%甲醛-水溶液中72 h，常規脫水、透明、包埋，制成連續切片，采用蘇木精伊紅染色，并于光鏡下觀察切片。由病理科醫生采用雙盲法對組織病理進行評分，其中胰腺病理評分標準參考Rongione評分法[7]，肝臟病理評分參考Camargo等[8]報道的評分標準，肺臟參考Jiang等[9]報道的評分標準；病理評分越高，組織損傷越嚴重。

1.3.3 血清指標的檢測 取各時段全血1 ml，800×g離心10 min，靜置10 min后吸取上清液；血清置于全自動生化分析儀檢測，采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清TNF- α和IL- 6的含量，氯化硝基苯- α- 半乳糖麥芽糖苷法檢測血清Amy的含量。相關檢測操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.4 免疫組化染色檢測各組織AQP3蛋白的表達 將組織樣本制成厚度約為4 μm的切片，二甲苯、酒精梯度洗脫，切片脫蠟至水，加入3%過氧化氫室溫孵育5 min，以消除內源性過氧化酶。自來水沖洗后PBS浸泡3 min，常規加入5%山羊血清封閉，室溫孵育10 min，加入1∶150兔抗鼠AQP3多克隆抗體，4 ℃孵育過夜。PBS沖洗3次，再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，自來水充分沖洗，復染，封片。結果判定由兩名病理科醫生采用盲法閱片，顯微鏡下隨機選擇10個視野，采用半定量法對細胞染色程度進行評分。染色強度無染色為0分，淺棕色后淡紅色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。著色細胞所占百分比染色細胞<5%為0分，染色細胞5%～25%為1分，染色細胞26%～50%為2分，染色細胞51%～75%為3分，染色細胞>75%為4分。以染色強度×染色細胞百分比作為總分，其中總分0分代表陰性，1～4分代表弱陽性，5～8分代表陽性，9～12分代表強陽性；其中1分以及上代表陽性。

1.3.5 免疫印跡法(Western blotting)檢測回腸中AQP3蛋白的表達 將樣本充分研磨后加入蛋白裂解液冰上充分裂解30 min，4 ℃、1 400g離心10 min，留取上清液，置于-80 ℃冰箱保存待檢。配置好上樣緩沖液，沸水中變性5 min，冰浴5 min；SDS- PAGE電泳分離蛋白，將電泳段轉移至PVDF膜上，電轉后將PVDF膜取出。5%脫脂牛奶封閉2 h，PBS沖洗3次，加入兔抗鼠AQP3多克隆抗體，室溫孵育1 h，4 ℃過夜；PBS沖洗3次；再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下振搖1 h，PBS沖洗3次。熒光圖像掃描及條帶灰度值分析，目的蛋白相對表達量為樣本條帶與GAPDH條帶灰度值之比。

1.3.6 實時熒光定量PCR(real- time quantitative PCR，RT- qPCR)檢測回腸AQP3的mRNA表達 按照RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，并逆轉錄成cDNA。引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司設計。AQP3上游引物序列為5′- AGCTGGATCGGCTTGAATTGT- 3′,下游為5′- AGTGAAAACGGCACGTGGAT- 3′,產物大小為379 bp；GAPDH上游引物序列為5′- CTGAAGTAGATCCTGTAGATGTTGCA- 3′,下游為5′- GTTGCCATTGTGACGGTTCAGT- 3′，產物大小為125 bp。PCR反應體系為ddH2O 24.5 μl、10×buffer緩沖液5 μl、dNTP 2 μl、上下游引物各0.5 μl，cDNA 5 μl、Taq酶0.5 μl，總反應體系38 μl；反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，65 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環后72 ℃ 5 min。記錄檢測指標的CT值，每組測量3次取平均值，以GAPDH為內參照，計算AQP3 mRNA相對表達量(2-ΔΔCT)；其中ΔCt=Ct(檢測樣品mRNA)-Ct(GAPDH mRNA)。

1.4 統計學處理

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據處理，計量資料采用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，各組間均數兩兩比較采用SNK- q檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組大鼠各組織形態學的改變

造模后Sham組大鼠的胰腺、肝臟、肺臟組織細胞排列整齊，形態結構清晰，細胞間隙未見炎癥細胞浸潤及水腫。Emodin組胰腺細胞較Model組清晰，炎性浸潤面積明顯縮??；肝細胞未見空泡樣變性，肺組織充血、水腫明顯減輕。Model組胰腺組織出現大量細胞壞死，并伴有炎癥細胞浸潤，腺泡結構不清；肝細胞結構混亂不清，細胞出現明顯腫脹，部分可見空泡樣變性；肺間質水腫或充血，部分可見肺泡融合而成的肺大皰。見圖1。

2.2 3組大鼠各器官病理評分的比較

Emodin組造模后24、48、72 h各組織病理評分呈顯著下降趨勢(P<0.05)；Sham組不同時間點胰腺、肝臟、肺臟組織病理評分顯著低于Emodin組和Model組(均P<0.05)，Emodin組病理評分顯著低于Model組(均P<0.05)。見表1。

2.3 3組大鼠不同時段血清Amy、TNF- α、IL- 6濃度變化的比較

Emodin組造模后24、48、72 h血清Amy、TNF- α、IL- 6水平均呈明顯下降趨勢(P<0.05)。Sham組不同時間點血清Amy、TNF- α、IL- 6濃度顯著低于Emodin組和Model組(均P<0.05)，Emodin組不同時間點血清Amy、TNF- α、IL- 6濃度顯著低于Model組(P<0.05)，見表2。

A.Sham組; B.Emodin組; C.Model組

圖1 造模48 h后3組大鼠胰腺、肝臟、肺臟組織形態學改變(HE ×200)

Fig 1 Pathological changes of rats’ pancreas,liver and lung in three groups after 48 h of model establishment(HE ×200)

組 別n胰腺病理評分肝臟病理評分肺臟病理評分12h48h72h12h48h72h12h48h72hSham組81．23±0．27ab1．19±0．24ab1．21±0．27ab0．17±0．04ab0．19±0．05ab0．17±0．03ab0．13±0．04ab0．14±0．07ab0．12±0．02abEmodin組810．31±2．17a8．47±1．06a4．09±0．74a2．17±0．39a1．54±0．13a1．21±0．09a1．75±0．18a1．32±0．13a0．94±0．07aModel組812．19±2．5411．72±1．6311．39±1．383．04±0．562．98±0．522．94±0．482．17±0．322．09±0．292．11±0．32

與Model組比較，aP<0.05; 與Emodin組比較，bP<0.05

組 別nAmy水平/(U·L-1)ρ(TNF?α)/(ng·L-1)ρ(IL?6)/(ng·L-1)24h48h72h24h48h72h24h48h72hSham組8875．3±31．6ab883．1±34．9ab859．7±30．5ab13．1±1．7ab12．9±1．4ab13．5±1．9ab51．7±6．1ab49．5±5．7ab50．7±5．9abEmodin組85493．6±103．5a5321．4±85．3a5439．4±71．2a87．4±8．4a85．5±4．7a85．5±2．1a714．3±41．3a729．4±31．6a711．5±19．5aModel組87638．7±132．76572．9±117．34329．5±109．3104．2±11．585．4±7．652．7±6．4974．6±81．7816．5±64．8713．8±43．7

與對照組比較，aP<0.05;與大黃素組比較， bP<0.05

2.4 3組大鼠不同時段回腸AQP3蛋白的表達

免疫組化染色顯示，Sham組AQP3蛋白呈弱表達，主要集中于回腸黏膜絨毛上端上皮細胞內；Model組AQP3蛋白呈強表達，并由回腸黏膜絨毛上端向隱窩延伸；Emodin組AQP3蛋白水平較Model組明顯減少，并主要集中分布于黏膜絨毛上端。Western blotting結果顯示，Emodin組造模后24、48、72 h AQP3蛋白水平均呈下降趨勢(P<0.05)，其中Sham組不同時間點AQP3蛋白水平顯著低于Emodin組和Model組(均P<0.05)，Emodin組顯著低于Model組(均P<0.05)。見圖2。

2.5 3組大鼠不同時段回腸AQP3的mRNA表達

Emodin組回腸AQP3的mRNA水平在造模后24、48、72 h呈逐漸下降的趨勢(均P<0.05)，Sham組不同時間點AQP3 mRNA顯著低于Emodin組和Model組(均P<0.05)，Emodin組不同時間點AQP3 mRNA顯著低于Model組(均P<0.05)，見圖3。

3 討 論

大黃素是從中藥大黃中提取的一類蒽醌類化合物?；A藥理學研究[11- 12]證實，大黃素具有導瀉、抑菌、免疫抑制、利尿、抗組胺等作用。Ni等[13]認為，大黃素能夠顯著降低SAP并發腹水形成，對SAP的預后具有顯著改善作用。臨床研究[14]顯示，大黃素聯合西藥治療能夠降低SAP的手術率和死亡率，其作用機制與緩解括約肌痙攣和抑制二十碳烯酸類血管活性物質有關。動物實驗[15]也證實，大黃素能夠促進胃腸道局部微循環，加速細胞和內毒素排除，并通過增加血供和氧供修復腸黏膜。

本研究顯示，與Sham組和Model組比較，Emodin組Amy、TNF- α、IL- 6水平呈下降趨勢，且Emodin組造模后血清Amy、TNF- α、IL- 6水平顯著低于Model組，說明大黃素能夠顯著降低炎癥因子的釋放，從而改善局部炎癥反應，緩解局部組織器官的損傷。Suboj等[16]報道,大黃素能夠顯著抑制大鼠腦缺血區組織ICAM- 1的表達，參與調節NF- κB信號途徑，降低中性粒細胞和炎癥介質的釋放，從而對局部組織起到保護作用。Yin等[17]證實,大黃素能夠下調Toll樣受體- 4 mRNA表達水平，抑制瘤壞死因子- α、二胺氧化酶能細胞因子釋放，對SAP腸屏障具有顯著改善作用。本研究顯示,Emodin組胰腺、肝臟、肺臟病理評分均顯著降低，說明大黃素對SAP引起的器官損傷具有保護作用，這可能與大黃素改善局部血液循環、緩解炎癥反應有關。

A.Sham組；B.Model組；C.Emodin組

圖2 3組大鼠不同時間點回腸AQP3表達水平(上行為免疫組化檢測，下行為Western blotting檢測)

Fig 2 AQP3 protein expression level of three groups in different time

圖3 3組大鼠回腸AQP3 mRNA在不同時間點的表達水平

Fig 3 AQP3 mRNA expression level of three groups in different time

AQP3是哺乳動物內廣泛存在的一類活性蛋白，參與特異性水轉運、細胞膜流動性、血管生長調節等過程[18- 19]。Matsuo等[20]將小鼠AQP3基因敲除，結果顯示小鼠腎集合管對水的通透性顯著降低，小鼠表現出多尿癥狀。Nong等[21]報道,小腸部分切除術患者隨著腸道AQP3 mRNA表達顯著升高，患者術后腹瀉明顯改善，AQP3在此過程中發揮了重要作用。大黃素具有通腑瀉下的作用。齊文杰等[22]證實,大黃提取的總蒽醌類化合物能夠導致大鼠腹瀉，回腸、結腸段AQP3、AQP4蛋白明顯下調。Masaldan等[23]報道,大黃酚、大黃素、大黃酸等能夠抑制LoVo細胞膜表面AQP3蛋白和mRNA的表達水平，這亦是大黃致瀉的主要機制。本研究顯示，隨著治療時間的延長，Emodin組AQP3蛋白和mRNA呈逐漸降低趨勢，且Emodin組不同時間點AQP3蛋白和mRNA均顯著低于Model組。說明SAP能夠誘導AQP3異常表達，而大黃素能夠下調AQP3表達水平，從而降低腸黏膜的通透性。

綜上所述，SAP病理改變與AQP3異常表達有關,大黃素能夠保護SAP的器官功能，降低炎癥因子釋放[24]，其作用機制可能與下調AQP3表達、降低腸黏膜通透性有關。

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《東南大學學報(醫學版)》唯一投稿網址：www.ddxbyxb.cn

Effect of emodin on organ function and AQP3 expression level in severe acute pancreatitic rats

CHEN Feng1,ZHAO Yu2,XIONG Wei3

(1.DepartmentofEmergency, 2.DepartmentofEmergencySurgery, 3.HepatobiliarySurgery,People’sHospitalofSichuan,Chengdu610072,China)

Objective: To investigate the organ function and AQP3 signal pathway effect of emodin on severe acute pancreatitis rats. Methods: A total of 72 rats accorded to the random number table method was divided into sham operation group (Sham group) of 24 rats, Model group of 24 rats and Emodin group of 24 rats, SAP model was established in the Emodin group and the Model group, same volume of normal saline was intraperitoneal injected into the pancreatic duct in the Sham group. The Emodin group was orally administered emodin, the Sham group and the Model group were given the same amount of normal saline. After 24 h, 48 h and 72 h of model establishment, 8 rats was sacrificed in each group, the pathological changes of pancreas, liver and lung were observed under electron microscope, serum TNF- α, IL- 6 level was detected by enzyme- linked immunosorbent test, serum Amy level was detected by chlorinated nitrobenzene alpha galactose method, ileal AQP3 protein expression level was detected by Western blotting, ileum AQP3 mRNA expression level was detected by quantitative real- time PCR. Results: 24 h, 48 h, 72 h after model establishment, pancreas, liver, lung tissue had significantly pathological changes in the three groups. After 24 h, 48 h, 72 h, histopathological score in the Emodin group showed a significant decreased trend (P<0.05). The pathological scores of the pancreas, liver, lung in the Sham group at different time points were significantly lower than those of the Emodin group and the Model group (P<0.05), moreover those of the Emodin group at different time points were significantly lower than those of the Model group (P<0.05).After 24 h, 48 h, 72 h, serum Amy,TNF- α,IL- 6 level in the Emodin group showed a significant decreased trend (P<0.05),those of the Sham group at different time points were significantly lower than those of the Emodin group and the Model group (P<0.05), those of the Emodin group at different time points were significantly lower than those of the Model group (P<0.05). After 24 h, 48 h, 72 h, AQP3 protein and mRNA in the Emodin group showed a significant decreased trend (P<0.05), AQP3 protein and mRNA in the Sham group at different time points were significantly lower than those of in the Emodin group and the Model group (P<0.05), with the former lower than the latter (P<0.05). Conclusion: The abnormal expression of AQP3 is related to SAP, emodin can protect the organ function of SAP and reduce the release of inflammatory factors, and its mechanism may be related to the down- regulation of AQP3 expression and decrease intestinal permeability.

Emodin; acute severe pancreatitis; aquaporin 3; inflammatory factor; rats

2016- 12- 21

2017- 05- 18

四川省衛生廳項目(080349)

陳鋒(1972-)，男，四川攀枝花人，副主任醫師，醫學碩士。E- mail:liushan12345624437@126.com

熊偉 E- mail:linyong63@163.com

陳鋒,趙煜,熊偉.大黃素通過影響AQP3表達水平改善急性重癥胰腺炎大鼠的器官功能[J].東南大學學報：醫學版，2017，36(4)：574- 580.

R576; R282.710.7

A

1671- 6264(2017)04- 0574- 07

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.04.016