煙粉虱及其優勢寄生蜂內共生菌的種類及系統發育分析

薛延韜，張毅波，張 焱，張桂芬，劉 懷，萬方浩*，葛金燕

(1.西南大學植物保護學院，昆蟲及害蟲控制工程重慶市重點實驗室，重慶 400715；2.中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；3.湖南農業大學植物保護學院，長沙 410128)

煙粉虱及其優勢寄生蜂內共生菌的種類及系統發育分析

薛延韜1,2，張毅波2，張 焱1,2，張桂芬2，劉 懷1，萬方浩2*，葛金燕3

(1.西南大學植物保護學院，昆蟲及害蟲控制工程重慶市重點實驗室，重慶 400715；2.中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；3.湖南農業大學植物保護學院，長沙 410128)

為了研究入侵我國的2個主要煙粉虱隱種BemisiatabaciMEAM1和MED及其3種優勢寄生蜂(淺黃恩蚜小蜂Encarsiasophia、麗蚜小蜂E.formosa、海氏槳角蚜小蜂Eretmocerushayati)體內感染內共生菌的種類豐度，并進一步探討其系統發育關系，本文利用分子生物學手段對昆蟲體內細菌的16S rRNA基因序列進行擴增、測序和分析，并采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)和最大似然法(Maximum Likehood, ML)分別構建優勢內共生菌的系統發育樹。結果表明，煙粉虱2個隱種內共生菌的種類豐度大于其3種優勢寄生蜂，3種優勢寄生蜂中麗蚜小蜂內共生菌的種類豐度最高；同源性分析發現煙粉虱和寄生蜂所攜帶的Rickettsia基因同源性達到99%，屬于Rickettsiabellii種，進一步的進化樹分析也發現所研究物種的Rickettsia和Hamiltonella均可各自聚為同一進化分支。煙粉虱及其優勢寄生蜂體內含有種類豐富的內共生菌，其中優勢內共生菌Rickettsia和Hamiltonella各自親緣關系很近，說明內共生菌在煙粉虱和寄生蜂間可能進行水平傳播。

煙粉虱；寄生蜂；內共生菌；16S rRNA；系統發育

煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)屬于半翅目Hemiptera，粉虱科Aleyrodidae，是一種典型的高度多食性的刺吸式害蟲，同時也是一種世界性的入侵害蟲，其可通過直接取食植物韌皮部汁液、傳播110多種植物病毒以及分泌蜜露誘發霉污病等方式為害作物，每年可導致數十億美元的經濟損失(Brownetal., 1995; Oliveiraetal., 2001; Jonesetal., 2003; Wanetal., 2016)。煙粉虱是一個獨特的、復雜的復合種，由至少36個形態上難以區分的隱種組成(Boykinetal., 2007; De Barroetal., 2010; Dinsdaleetal., 2010; Liuetal., 2012; Firdausetal., 2013)。其中，“中東-小亞細亞1”隱種(Middle East-Asia Minor 1，簡稱MEAM 1，以前稱之為“B型”)和“地中?！彪[種(Mediterranean，簡稱MED，以前稱之為“Q型”)是世界范圍內的2個主要入侵煙粉虱隱種(Tayetal., 2012)，在過去的30多年里，在全世界造成了巨大的農業損失(Daltonetal., 2006; Zhangetal., 2015)。

在我國，煙粉虱MEAM1和MED隱種是分布最廣泛、為害最嚴重的2個入侵隱種(Panetal., 2011)。MEAM1隱種于20世紀90年代中后期傳入，并且很快地取代了本地種，而MED隱種于2003年第一次在我國云南昆明發現(Chuetal., 2006)。之后，MED隱種逐漸取代MEAM1隱種成為我國田間的主要發生種(Chuetal., 2010; Tengetal., 2010; Panetal., 2011)。MEAM1隱種具有較強的入侵能力和競爭力，而MED隱種具有較強的抗藥性(Horowitzetal., 2003; Pascualetal., 2004; Dennehyetal., 2010)。隨著化學農藥的大范圍使用，煙粉虱的抗藥性也逐漸增強。為了避免進入農藥使用量增加和抗藥性增強的惡性循壞，利用生防作用物開展煙粉虱生物防治成為了當前的研究熱點。生防作用物中，寄生性天敵又是最重要的組成部分。煙粉虱的寄生性天敵主要分布于恩蚜小蜂屬Encarsia和槳角蚜小蜂屬Eretmocerus，其中應用較為廣泛的優勢寄生蜂有麗蚜小蜂Encarsiaformosa，淺黃恩蚜小蜂Encarsiasophia以及海氏槳角蚜小蜂Eretmocerushayati3種。

煙粉虱體內攜帶有種類豐富的內共生菌，目前已報道有8種/屬(Shanetal., 2016)。不同煙粉虱隱種所攜帶的次生內共生菌(Secondary endosymbiont)種類不同，包括“CandidatusHamiltonella defense”(Zchori-Feinetal., 2002)，“CandidatusWolbachia sp.”(Nirgianakietal., 2003)，Arsenophonussp.(Zchori-Feinetal., 2002)，“CandidatusFritschea bemisiae” (Everettetal., 2005)，“CandidatusCardinium hertigii”(Weeksetal., 2003)，Rickettsiasp.(Gottliebetal., 2006)和“CandidatusHemipteriphilus asiaticus”(Bingetal., 2013)。但是，它們都攜帶有相同的且能夠為其提供維持生命活動所必需的營養物質的初生內共生菌(Primary endosymbiont)“CandidatusPortiera aleyrodidarum”(Sloanetal., 2012)。近年來，越來越多的研究表明，煙粉虱體內內共生菌在其種群擴散和入侵方面發揮了重要作用。比如，有研究發現雙重感染Rickettsia-Arsenophonus或Wolbachia-Arsenophonus的煙粉虱MED隱種比只感染Arsenophonus的煙粉虱MED隱種對啶蟲脒、噻蟲嗪、吡蟲啉和螺甲螨酯的敏感性較高(Ghanimetal., 2009)，表明內共生菌可能與煙粉虱的抗藥性相關。Brumin等(2011)發現在以色列的煙粉虱MEAM1隱種種群中，熱激情況下分布于類菌體外部的Rickettsia會降低，而處于類菌體內部的Portiera和Hamiltonella幾乎不受影響；而Shan等(2014)發現在中國的煙粉虱MEAM1隱種種群中，在高溫處理下處于類菌體內部的Portiera和Hamiltonella均降低，而分散的Rickettsia幾乎不受影響，這表明內共生菌可能與煙粉虱的耐熱性相關。因此，以次生內共生菌作為對象來研究煙粉虱的生物學特性、入侵能力及對隱種間取代的影響成為了當前的熱點(Chuetal., 2011; Himleretal., 2011)。

除了煙粉虱外，許多研究也圍繞共生菌在煙粉虱的優勢寄生蜂中的傳播和功能展開。Chiel等(2009)研究表明Rickettsia在寄生蜂Eretmocerusemiratus和Eretmoceruseremicus體內沒有進入卵母細胞，僅局部存在于卵泡細胞，所以Rickettsia無法在這兩種寄生蜂體內進行垂直傳播，在寄生蜂Encarsiapergandiella體內也只是短暫存在于消化道中，并在化蛹前排出體外；同時，水平傳播實驗的結果則表示寄生蜂通過與感染Rickettsia的煙粉虱接觸后能夠普遍獲菌，但是一旦離開含菌粉虱，寄生蜂的感菌率又會急劇下降(Maetal., 2004)。煙粉虱與寄生性天敵之間大多都是專性寄生，對于煙粉虱及其寄生蜂共同攜帶的內共生菌種類和系統發育的研究，將有助于更加明確內共生菌在煙粉虱和寄生蜂之間的傳播方式，以期為深入研究寄生蜂對煙粉虱的防控提供理論基礎。

為了明確入侵我國的2個主要煙粉虱隱種BemisiatabaciMEAM1和MED及其3種優勢寄生蜂(淺黃恩蚜小蜂En.Sophia、麗蚜小蜂En.formosa、海氏槳角蚜小蜂Er.hayati)體內感染內共生菌的種類和豐度，并探討其系統發育關系，本文采用分子生物學手段，通過克隆擴增出昆蟲體內細菌的16S rRNA基因序列，連接轉化后，經基因測序明確內共生菌的種類和豐度，并利用生物信息學的相關方法進行基因同源性分析，進一步對優勢內共生菌開展系統發育分析。研究結果能夠明確煙粉虱和寄生蜂體內感染內共生菌的種類和豐度，以及內共生菌在“煙粉虱-寄生蜂”種群間可能的傳播途徑，為今后煙粉虱及其優勢寄生蜂內共生菌的深入研究提供參考，也有助于研究人員進一步理解內共生菌在“粉虱-寄生性天敵”互作中的重要作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1供試昆蟲

煙粉虱MEAM1和MED隱種種群采自河北省廊坊市中國農業科學院植物保護研究所廊坊中試基地，不同隱種通過線粒體細胞色素氧化酶Ⅰ基因(mtDNA-COⅠ)進行檢測鑒定后，分別用籠罩單獨飼養，并定期通過RAPD-PCR進行檢測；3種寄生蜂分別為海氏槳角蚜小蜂、淺黃恩蚜小蜂和麗蚜小蜂，其中海氏槳角蚜小蜂和淺黃恩蚜小蜂種群于2008年從美國德克薩斯農工大學引入，麗蚜小蜂種群采集地與煙粉虱相同，三者均以煙粉虱為寄主用籠罩單獨飼養。上述種群自采集或引入后，長期飼養于中國農業科學院植物保護研究所生物入侵研究室的溫室中，氣候條件為溫度26℃-28℃、相對濕度65%±5%、光周期14 L ∶10 D。

1.1.2供試植物

煙粉虱使用棉花Gossypium進行飼養，品種為“中棉6號”，由中國農業科學院植物保護研究所廊坊農藥廠提供。棉花種子種植于含營養土(組成：草木灰/蛭石為1 ∶1)的塑料花盆(規格：上口徑10 cm×10 cm，高約9 cm)中，每盆2-3粒種子，放置在120目紗網的大型養蟲籠(規格：60 cm×40 cm×60 cm)于溫室中，待株高大于20 cm且至少有2片真葉時即可使用。培養條件與供試昆蟲相同，供試植物不接觸任何農藥。

1.2 實驗方法

1.2.1煙粉虱DNA的提取

用組織基因組DNA提取試劑盒提取煙粉虱的DNA。所用試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit)由天根生化有限公司生產。取20頭煙粉虱于滅菌的1.5 mL離心管中，放入-20℃冰箱冷凍5-8 min，加液氮研磨后，按照試劑盒說明書進行操作，最后將得到的煙粉虱DNA提取液置于1.5 mL離心管中，短暫低速離心，-20℃保存備用。

1.2.2寄生蜂DNA的提取

用裂解液法提取3種優勢寄生蜂的DNA。研磨方法與煙粉虱DNA提取相同，之后加入50 μL的裂解液(10 mM Tris-HCL，pH 8.4；50 mM KCl；0.45% Tween 20；0.45% NP40；0.2% Gelatin；60 μg/mL Proteinase K)；將帶有勻漿液的離心管置于65℃金屬浴30 min、96℃金屬浴10 min；短暫低速離心，即得到寄生蜂DNA提取液，-20℃保存備用。

1.2.3細菌16S rRNA基因序列的PCR擴增

分別以所獲得的煙粉虱和寄生蜂的總DNA為模板，利用細菌16s rRNA基因通用引物27F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1492R(5′-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)(Weisburgetal., 1991)進行PCR擴增。擴增反應體系(25 μL)包括：總DNA模板2.0 μL、10×Buffer 2.0 μL、dNTPs 2.5 μL、雙向引物各1.0 μL、Taq聚合酶0.2 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應程序如下：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，共30個循環；72℃后延伸7 min，4℃保存。對于每種DNA樣品，均設置3個重復的PCR反應；對于每次PCR反應，均設置含目的片段的煙粉虱或寄生蜂DNA和ddH2O分別作為陽性和陰性對照。擴增反應在ABI-9700 PCR基因擴增儀上進行。擴增完成后將3個重復的PCR產物合并一起，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，以GelDoc Universal Hood II型凝膠成像系統分析結果，擴增片段大小約為1500 bp。

1.2.4PCR產物的純化、連接、轉化及測序

使用DNA凝膠回收試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收PCR產物。所用試劑盒(AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒)由康寧生命科學有限公司提供。所有操作按照試劑盒說明書進行。純化所得PCR產物連接到PEASY-T3載體中，將其轉入Trans-T1感受態細胞；每個物種選取40個有效菌落進行驗證，將其中正確的轉化子送上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.3 數據分析

1.3.1內共生菌的種類分析

利用Bioedit 7.2.6軟件(Hall, 1999)對測序所得的16S rRNA基因序列進行拼接并輔以人工矯正等處理后，在NCBI上進行BLAST同源性比對分析，以同源性在99%-100%為標準，對內共生菌的種類進行鑒定，并分別對各內共生菌的數量進行統計，同時記錄比對時各序列同源性最高的序列信息；在Ribosomal Database Project(RDP)上對共生菌16S rRNA基因序列進行Classifier歸類(Wangetal., 2007)。

1.3.2系統發育分析

基于1.3.1的分析結果，進一步對煙粉虱MEAM1和MED隱種及其3種優勢寄生蜂感染的優勢內共生菌進行系統發育分析。以Bioedit 7.2.6軟件讀取序列，對每條序列進行人工堿基讀取和反復校對；采用DAMBE 6.4.79軟件(Xia, 2017)對核苷酸替代飽和性進行分析；選取NCBI中已報道的不同宿主攜帶的上述優勢內共生菌及隸屬于同屬不同群組的多條16S rRNA基因序列作為參考序列，并選取外群(Outgroup)，結合本研究測序獲得的5個物種攜帶的優勢內共生菌16S rRNA基因序列，利用Clustal W程序對序列進行多重序列比對，并輔以人工校對；應用Mega 7.0.26(Kumaretal., 2016)軟件以雙參數模型(Kimura 2-parameter, K2-P)，采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)和最大似然法(Maximum Likehood, ML)分別構建系統發育樹，系統發育樹分支的置信度采用自展法(Bootstrap analysis, BP)，重復檢測1000次。

2 結果與分析

2.1 煙粉虱MEAM1和MED及其3種優勢寄生蜂內共生菌的種類豐度分析

對測序所得的煙粉虱MEAM1和MED隱種及其3種優勢寄生蜂內共生菌16S rRNA基因序列的同源性比對表明，這5個物種感染內共生菌的種類豐度有明顯的差異(表1)。煙粉虱2個隱種均攜帶Portiera、Hamiltonella和Rickettsia，其內共生菌的種類豐度要大于3種優勢寄生蜂；3種優勢寄生蜂中以麗蚜小蜂內共生菌的種類豐度最高，其攜帶有Rickettsia、Hamiltonella和Wolbachia，另外2種寄生蜂則只含有Rickettsia；5個不同物種均攜帶Rickettsia，海氏槳角蚜小蜂Rickettsia的種類豐度顯著高于其他物種。

內共生菌16S rRNA基因序列同源性比對中相似度最高的序列信息及Classifier歸類結果見表2。煙粉虱MEAM1和MED隱種及其3種優勢寄生蜂體感染有Portiera、Hamiltonella、Rickettsia和Wolbachia4種內共生菌，均隸屬于變形菌門Proteobacteria，其中Rickettsia屬于α-變形細菌綱(α-Proteobacteria)，Portiera、Hamiltonella和Wolbachia則屬于γ-變形細菌綱(γ-Proteobacteria)，每一條序列與NCBI基因庫中比對到的序列的相似度均達到99%。

2.2 煙粉虱MEAM1和MED及其3種優勢寄生蜂的優勢內共生菌的系統發育分析

由2.1結果可知，煙粉虱MEAM1和MED隱種及其3種優勢寄生蜂共同感染的內共生菌有Rickettsia和Hamiltonella2種，為其優勢內共生菌。煙粉虱MEAM1和MED隱種及其3種優勢寄生蜂均攜帶有Rickettsia，攜帶Hamiltonella的有煙粉虱MEAM1和MED隱種及3種優勢寄生蜂中的麗蚜小蜂。下面分別對2種優勢內共生菌進行系統發育分析。

表1 煙粉虱MEAM1和MED隱種及其3種優勢寄生蜂內共生菌的種類豐度

注：1.Others為比對結果不屬于已報道的8種/屬內共生菌；2.“-”表示不含有某種菌。Note: 1. The BLAST results not belonging to the eight species of endosymbiosis that have been reported count in the others; 2. The sign “-” indicates free for one bacterium.

表2 煙粉虱MEAM1和MED隱種及其3種優勢寄生蜂內共生菌16S rRNA基因序列比對信息及分類地位

2.2.1優勢內共生菌Rickettsia系統發育樹的構建

在NCBI數據庫中選取Rickettsia屬的28個16S rRNA同源基因序列作為參考序列，以纖毛蟲Diophrysappendiculata的Rickettisa16S rRNA基因作為外群，結合本研究測序獲得的煙粉虱MEAM1和MED隱種及其3種優勢寄生蜂的Rickettisa16S rRNA基因序列，采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)和最大似然法(Maximum Likehood, ML)構建系統發育樹，結果分別如圖1和圖2所示。

采用NJ法對Rickettsia構建的系統發育樹(圖1)中，本研究中的煙粉虱MEAM1和MED隱種及其3種優勢寄生蜂的Rickettsia與數據庫中以色列的煙粉虱MEAM1隱種和日本的煙粉虱MED隱種的Rickettsia首先聚為一支，然后再與豌豆蚜Acyrthosiphonpisum、葉蟬Empoascapapayae、葉螨Tetranychusurticae、盲蝽象Macrolophuspygmaeus、煙盲蝽Nesidiocoristenuis及寄生蜂Pnigaliosoemius的Rickettsia和Rickettsiabellii聚為一大支，而與纖毛蟲D.appendiculata的Rickettisa親緣關系最遠。采用ML法對Rickettsia構建的系統發育樹(圖2)表現出與NJ法類似的結果。

圖1 鄰接法構建的煙粉虱MEAM1和MED及其3種優勢寄生蜂Rickettsia的系統發育樹(包含參考序列和外群)Fig.1 Neighbor-Joining tree based on the analysis of Rickettsia from B. tabaci MEAM1, MED and its three dominant parasitoids (including the reference sequences and outgroup)

圖2 最大似然法構建的煙粉虱MEAM1和MED及其3種優勢寄生蜂Rickettsia的系統發育樹(包含參考序列和外群)Fig.2 Maximum Likehood based on the analysis of Rickettsia from B. tabaci MEAM1, MED and its three dominant parasitoids (including the reference sequences and outgroup)

2.2.2優勢內共生菌Hamiltonella系統發育樹的構建

在NCBI數據庫中選取Hamiltonella屬的20個16S rRNA同源基因序列作為參考序列，以水生拉恩氏菌Rahnellaaquatilis和小腸結腸炎耶爾森氏菌Yersiniaenterocolitica的16S rRNA基因作為外群，結合本研究測序獲得的煙粉虱MEAM1和MED隱種及麗蚜小蜂En.formosa的Hamiltonella16S rRNA基因序列，采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)和最大似然法(Maximum Likehood, ML)構建系統發育樹，結果分別如圖3和圖4所示。

圖3 鄰接法構建的煙粉虱MEAM1和MED及其3種優勢寄生蜂Hamiltonella的系統發育樹(包含參考序列和外群)Fig.3 Neighbor-Joining tree based on the analysis of Hamiltonella from B. tabaci MEAM1, MED and its three dominant parasitoids (including the reference sequences and outgroup)

圖4 最大似然法構建的煙粉虱MEAM1和MED及其3種優勢寄生蜂Hamiltonella的系統發育樹(包含參考序列和外群)Fig.4 Maximum Likehood based on the analysis of Hamiltonella from B. tabaci MEAM1, MED and its three dominant parasitoids (including the reference sequences and outgroup)

采用NJ法對Hamiltonella構建的系統發育樹(圖3)中，本研究中的煙粉虱MEAM1和MED隱種及麗蚜小蜂En.formosa的Hamiltonella與數據庫中中國的煙粉虱MEAM1和MED隱種及以色列的煙粉虱MEAM1隱種的Hamiltonella聚為一小支，然后與美國的煙粉虱MEAM1隱種的Hamiltonella聚為一大支；而與其余物種的Hamiltonella均未在同一分支；與水生拉恩氏菌R.aquatilis和小腸結腸炎耶爾森氏菌Y.enterocolitica親緣關系最遠。采用ML法對Hamiltonella構建的系統發育樹(圖4)表現出與NJ法類似的結果。

3 結論與討論

在本研究中，煙粉虱MEAM1和MED隱種感染的Hamiltonella含量均最高，這與以前的報道相一致。目前，Hamiltonella和Rickettsia已成為煙粉虱的優勢次生內共生菌。但是，Chu等(2011)研究表明，除了Hamiltonella和Rickettsia外，這兩種煙粉虱隱種還會感染有Wolbachia、Arsenophonus和Cardinium。由于內共生菌在煙粉虱體內是不固定的，因此，生物和非生物環境等因素都會對內共生菌產生影響，它們可以直接作用于內共生菌，或者間接影響宿主，從而導致昆蟲胞內共生菌與宿主之間關系的不穩定性(Cassetal., 2015)。例如，共生菌Wolbachia在澳大利亞黑腹果蠅Drosophilamelanogaster種群中的感染率比較穩定(Hoffmannetal., 1994; Hoffmannetal., 1998)；共生菌Serratia可保護蚜蟲抵抗熱激(Russelletal., 2006)，并與蚜蟲分布在干旱地區有關(Henryetal., 2013)；共生菌Cardinium在庫蠓Culicoidesis中的感染率與地中海地區地面的溫度有關(Moragetal., 2012)；在日本，感染共生菌Regiella能夠影響豌豆蚜A.pisum宿主的?；?Tsuchidaetal., 2004)；在美國，Rickettsia的感染頻率在不同地區之間存在差異：在西南部的棉花種植區感染頻率特別高，而在圣華金河谷和德克薩斯州的東南以及南部的部分地區處于中間感染水平(Cassetal., 2015)；同樣，Shan等(2014)對我國田間采集到的煙粉虱MEAM1和MED隱種檢測發現，MEAM1隱種攜帶有初生內共生菌Portiera及2種次生內共生菌Hamiltonella和Rickettsia，而MED隱種則攜帶Portiera和Hamiltonella。這些結果都表明，昆蟲體內內共生菌的存在與變化受多種因素的影響。

準確鑒定煙粉虱及其寄生蜂攜帶的內共生菌種類并對其進行系統發育分析，對于研究內共生菌與宿主間的互作關系意義重大。本研究中，通過對昆蟲內共生菌16S rRNA基因序列進行BLAST同源性比對和Classifier歸類，得到了內共生菌鑒定和分類相同的結果；在以Rickettsia或Hamiltonella的16S rRNA基因序列為靶標對兩者進行系統發育分析時，無論是鄰接法還是最大似然法，煙粉虱MEAM1和MED隱種及其3種優勢寄生蜂的Rickettsia或Hamiltonella均聚為一支，且就煙粉虱及其寄生蜂而言可形成獨立的進化支，其聚類結果也符合BLAST同源性比對和Classifier歸類結果。這說明內共生菌的16S rRNA基因可用于對其進行鑒定和分類分析。

無論是煙粉虱還是寄生蜂的內共生菌均屬于變形菌門的α-變形細菌綱或γ-變形細菌綱。已有研究表明，Rickettsia可分為4個分支，即bellii group、transitional group、spotted fever group和typhus group，而本研究中煙粉虱和寄生蜂攜帶的Rickettsia16s rRNA基因序列均聚為一支，屬于Rickettsiabellii group，與其他取食植物韌皮部汁液類的刺吸式昆蟲如蚜蟲和葉蟬的Rickettsia也有較近的親緣關系(Bruminetal., 2012)。此外，除了MEAM1和MED隱種外，Rickettsia在煙粉虱Asia II 3(即“ZHJ1型”)、Asia II 7(即“Cv型”)、Indian Ocean(即“MS型”)和China 1(即“ZHJ3型”)等隱種上均有報道(Bingetal., 2013)。對于Hamiltonella而言，本研究中煙粉虱和寄生蜂的Hamiltonella16s rRNA基因序列同其他4個煙粉虱種群均聚為一支，說明煙粉虱感染的Hamiltonella具有較近的親緣關系。這說明，刺吸式昆蟲煙粉虱及其優勢寄生蜂所攜帶的Rickettsia和Hamiltonella在“煙粉虱-寄生蜂”間可能存在水平傳播，同時也進一步說明，內共生菌在不同宿主昆蟲之間進行相互感染和傳播的可能性很大。

在煙粉虱中，Rickettsia的分布呈現多樣性(Gottliebetal., 2006)，而其他內共生菌都存在于宿主的菌胞中。有研究表明，Rickettsia一般隨卵母細胞進行垂直傳播，而進一步研究發現，在煙粉虱成蟲的中腸中聚集有大量的Rickettsia，其可能是在卵母細胞和卵細胞發育后期進入腸組織(Bruminetal., 2012)。對于內共生菌在宿主體內的分布和傳播，還有待進一步研究。

本研究中所用的煙粉虱種群都攜帶有Portiera、Hamiltonella和Rickettsia，其寄生蜂都攜帶有Rickettsia，部分攜帶有Hamiltonella或Wolbachia，而宿主體內內共生菌的存在受多種因素的影響，不同種群攜帶的內共生菌種類豐度存在一定差異，對于本研究討論的Rickettsia和Hamiltonella以外的其他內共生菌的鑒定及系統發育情況，還有待于進一步對其他種群進行研究。此外，本研究選取細菌16s rRNA基因進行測序，其存在于所有細菌的基因組中，具有高度的保守性，但是相對于其他技術方法，如宏基因組測序而言，仍存在一定的局限性。例如，16s rRNA基因測序得到的序列很多鑒定不到種水平，而宏基因組測序能鑒定微生物到種水平甚至菌株水平。

寄生蜂對于煙粉虱具有較大的控害效果和防治潛力，對寄生蜂和煙粉虱共同感染的內共生菌的種類及系統發育研究，不僅有助于進一步明確內共生菌對于宿主的重要作用及其在“煙粉虱-寄生蜂”間可能存在水平傳播途徑，還可為深入研究內共生菌在“煙粉虱-寄生蜂”間的互作關系提供一定參考。

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DiversityandphylogeneticaffiliationofendosymbiontsfromBemisiatabaci(Hemiptera:Aleyrodidae)anditsdominantparasitoids

XUE Yan-Tao1,2, ZHANG YI-Bo2, ZHANG Yan1,2, ZHANG Gui-Fen2, LIU Huai1, WAN Fang-Hao2*, GE Jin-Yan3

(1. Chongqing Key Laboratory of Entomology and Pest Control Engineering, College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. State Key Laboratory for the Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Plant Protection Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 3. College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

To determine the diversity and phylogenetic affiliation of endosymbionts harboured by two mainly invasive cryptic speciesBemisiatabaciMEAM1 and MED and its three dominant parasitoids (Encarsiasophia,En.formosa,Eretmocerushayati), the 16S rRNA gene sequences of the endosymbionts was cloned, sequenced and analyzed using molecular biology methods. Phylogenetic trees based on the sequences of the dominant endosymbionts were constructed with Neighbor-Joining (NJ) and Maximum Likehood (ML). The results showed that the symbiotic diversity ofB.tabaciMEAM1 and MED was greater than those of the three dominant parasitoids. Among three dominant parasitoids, the diversity of endosymbionts inEn.formosawas the highest. In the homology analysis, theRickettsiain the five insect species had 99% similarity, and all belonged toRickettsiabelliigroup. The phylogenetic trees showed that theRickettsiain the five insect species were clustered together, and theHamiltonellashowed similar results. It suggested thatB.tabaciand its three dominant parasitoids contained a variety of endosymbionts, and the dominant endosymbiontsRickettsiain the five insect species have a close genetic relationship, which is conformed to theHamiltonella, indicating that the endosymbionts could occur horizontal transmission betweenB.tabaciand parasitoids.

Bemisiatabaci; parasitoids; endosymbionts; 16S rRNA; phylogenetic

國家重點研發專項(2016YFC1202100)；中國博士后基金面上基金(2015M570183)；泰山學者項目；國家國際科技合作專項資助(2015DFG32300)

薛延韜，男，1992年生，碩士研究生，研究方向為入侵生物學，E-mail：yantao_xue@163.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: wanfanghao@caas.cn

Received: 2017-07-17; 接受日期Accepted: 2017-07-31

Q968;S476+.3

：A

1674-0858(2017)04-0741-11

薛延韜，張毅波，張焱,等.煙粉虱及其優勢寄生蜂內共生菌的種類及系統發育分析[J].環境昆蟲學報，2017,39(4):741-751.