快速鑒定新菠蘿灰粉蚧的分子標記技術

馬光昌，王曉妮，牛黎明，龔 治，溫海波，金啟安，彭正強

(中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所，?？?571101)

快速鑒定新菠蘿灰粉蚧的分子標記技術

馬光昌，王曉妮，牛黎明，龔 治，溫海波，金啟安，彭正強*

(中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所，?？?571101)

新菠蘿灰粉蚧Dysmicoccusneobrevipes(Beardsley)是一種嚴重為害劍麻、番荔枝等經濟作物的入侵性害蟲。由于粉蚧類昆蟲體型較小，且外部形態十分相似，難以達到快速準確識別。本文利用分子標記技術，研究了新菠蘿灰粉蚧的快速鑒定方法。通過對新菠蘿灰粉蚧、扶桑綿粉蚧、雙條拂粉蚧、杰克貝爾氏粉蚧、大洋臀紋粉蚧、木槿曼粉蚧、甘蔗粉蚧和木瓜粉蚧等8種粉蚧的序列進行分析，針對新菠蘿灰粉蚧設計了1對特異性引物，其擴增片段大小為552 bp(GenBank登錄號為MF 363108)，該引物對其它7種粉蚧沒有擴增能力。該引物不僅對新菠蘿灰粉蚧成蟲具有擴增效能，對1齡若蟲、2齡若蟲和3齡若蟲都具有同樣的擴增能力，其最低檢出閾值為437.5 pg/μL。該技術的建立，實現了在劍麻等苗木調運過程中對新菠蘿灰粉蚧的快速準確鑒定，同時對新菠蘿灰粉蚧的檢疫和監測也具有重要的意義。

新菠蘿灰粉蚧；分子標記；快速鑒定；特異性擴增

新菠蘿灰粉蚧Dysmicoccusneobrevipes(Beardsley)屬半翅目Hemiptera，粉蚧科Pseudococcidae，潔粉蚧屬Dysmicoccus(Beardsley，1959)，被我國列為進境植物檢疫性有害生物。該蟲主要分布在美國夏威夷、墨西哥、巴哈馬群島、西印度群島、哥倫比亞以及巴西等地區，是當地發生最嚴重的一種有害生物。

新菠蘿灰粉蚧寄主廣泛，主要為害劍麻、菠蘿、柑橘、番茄、可可和香蕉等農林經濟作物(Jaymaetal.，1992；林曉佳等，2013)，尤其是劍麻為害最為嚴重。在1998年，該害蟲首次在我國海南省昌江縣劍麻產區發現，為新入侵海南害蟲。該害蟲為胎生，有群集的習性，主要在劍麻的根、莖、葉片部位聚集，且可隱藏在劍麻葉片的裂縫和翹皮下(張小冬等，2008)。該害蟲主要刺吸劍麻的汁液，以嫩葉為主，影響劍麻的生長發育，其分泌蜜露可引致煤煙病，直接影響劍麻的產量和質量，危害嚴重時可導致劍麻植株死亡。近年來，該蟲在海南和廣東劍麻產區暴發成災，造成劍麻減產多達30%(陳澤坦等，2010)。

新菠蘿灰粉蚧雌成蟲蟲體呈橢圓形，體外被白色蠟質分泌物覆蓋。體長約2.5-4.5 mm，寬約1.5-2.0 mm。觸角細索狀，共8節，尾端有2根顯著伸長的臀瓣刺。1齡若蟲蟲體呈長橢圓形，體色為淡黃色，體長約0.5 mm，單眼1對，紅色。后期背部有少量均勻的蠟質分布。2齡若蟲體色由黃褐色變淡灰色加深。達到3若蟲時蟲體被自身所分泌的蠟質物均勻覆蓋(Beardsley，1965；湯祊德，1992；王子清，2001；張小冬等，2008)。由于蚧蟲體極小，單憑傳統的形態分類方法(個體大小、剛毛的長短和透明孔的有無等特征)進行鑒定耗時耗力。因此，本文針對新菠蘿灰粉蚧研究了其快速分子鑒定技術，同時以扶桑綿粉蚧、雙條拂粉蚧、杰克貝爾氏粉蚧、大洋臀紋粉蚧、木槿曼粉蚧、甘蔗粉蚧和木瓜粉蚧等粉蚧為靶標進行了特異性檢驗。研究結果旨為有效地阻止新菠蘿灰粉蚧通過劍麻苗木調運等方式從疫區向非疫區為害或向其他寄主蔓延，盡可能降低其所造成的經濟損失和傳播擴散的速度，保障國家的農業生產安全及其產品貿易安全。

1 材料與方法

1.1 供試材料

將野外采集到的粉蚧標本浸泡于95%酒精放入-20℃冰箱中備用。經傳統的形態分類鑒定后，粉蚧種類主要有新菠蘿灰粉蚧、扶桑綿粉蚧、雙條拂粉蚧、杰克貝爾氏粉蚧、大洋臀紋粉蚧、木槿曼粉蚧、甘蔗粉蚧和木瓜粉蚧等8種。

1.2 粉蚧DNA提取

采用酚氯仿抽提法提取DNA。將單頭粉蚧標本置于含有200 μL提取液(10 mmol/L Tris-HCI，1 mmol/L EDTA，1% SDS，pH 8.0)中，用封口槍頭充分研磨；加入5 μL蛋白酶K(20 mg/mL)于研磨后的勻漿液中，混勻后于56℃水浴2 h(每30 min混勻1次)；第一次抽提加1倍體積苯酚/氯仿(1 ∶1)于反應混合液中，混勻，離心10 min(4℃，10000 r/min)。吸取上清后用等體積氯仿按上法再抽提一次。吸取上清，用2倍體積100%冰凍乙醇沉淀1 h，離心20 min(4℃，12000 r/min)，棄上清，晾干后用30 μL無菌水充分溶解DNA于-20℃保存備用。

1.3 PCR擴增與克隆測序

采用核糖體rDNA區通用引物ITS18S：(5′-TACACACCGCCCGTCGCTACTA-3)和ITS5.8S：(5′- ATGTGCGTTCRAAATGTCGATGTTCA-3′)進行擴增。引物由上海生工生物技術有限公司合成。PCR反應采用25 μL反應體系，其中含有2 μL DNA溶液，2.5 μL10×Pfu buffer，0.6 μL Mg2+(100 mmol/L)，0.5 μL 10 mmol/L dNTP混合液，引物(10 μmol/L)各0.8 μL，Pfu DNA聚合酶(2.5 U/μL，北京全式金生物技術有限公司)0.5 μL，17.3 μL ddH2O。反應條件為：94℃變性5 min；95℃ 20 s，53℃ 40 s，72℃ 1 min，35個循環后72℃保溫8 min。取2.5 μL擴增產物于含有溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后在紫外光下檢測結果并拍照。

《二月》中第一封信和第四封信問句較為集中,分別為13句、15句。由二句組合、三句組合、四句組合等。例如:

所得目的片段用PCR產物直接雙向測序，測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.4 序列分析與新菠蘿灰粉蚧特異性引物設計

對獲得的8種不同粉蚧的序列進行比對分析，針對新菠蘿灰粉蚧，找到該蟲與其它粉蚧的特異區域，利用Oligo 6.0軟件，在這個區域設計新菠蘿灰粉蚧的特異性引物D. ne-F：5′-ATTGAACGA CCGCAGTGA-3′和D.ne-R：5′-GTCTGTTTATACTT GGGG-3′(上海生工生物技術有限公司合成)，擴增片段552 bp(GenBank登錄號為MF 363108)。PCR的反應體系為15 μL，其中，10×PCR Buffer 1.5 μL，各2.5 mM的dNTP Mixture 1.2 μL，10 μM D.ne-F/D. ne-R引物各0.2 μL，25 mM Mg2+1.2 μL，BSA 0.3 μL，TaKaRa Taq 0.2 μL，10 ng模板DNA 0.6 μL，ddH2O 9.6 μL；PCR反應程序為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30個循環；72℃延伸10 min。取2.5 μL擴增產物于含有溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后在紫外光下檢測結果并拍照。

1.5 新菠蘿灰粉蚧引物的種特異性及靈敏性檢驗

分別以新菠蘿灰粉蚧、扶桑綿粉蚧、雙條拂粉蚧、杰克貝爾氏粉蚧、大洋臀紋粉蚧、木槿曼粉蚧、甘蔗粉蚧和木瓜粉蚧的DNA為模板，檢驗新菠蘿灰粉蚧特異性片段擴增引物D.ne-F/D.ne-R的種特異性。與此同時，提取不同蟲態(1齡若蟲、2齡若蟲、3齡若蟲和成蟲)的新菠蘿灰粉蚧的DNA為模板，對目的片段擴增效果進行檢驗。取單頭成蟲原模板DNA溶液(140 ng/μL)稀釋10倍后以2倍進行遞減稀釋至437.5 pg/μL，然后以稀釋后的濃度為模板(14 ng/μL、7 ng/μL、3.5 ng/μL、1.75 ng/μL、875 pg/μL、437.5 pg/μL)進行最低檢出閾值的測定。每一種類和不同蟲態的樣本分別檢測3頭。

2 結果與分析

2.1 新菠蘿灰粉蚧引物的種特異性檢測

以所設計的D.ne-F/D.ne-R新菠蘿灰粉蚧種特異性引物分別對新菠蘿灰粉蚧、扶桑綿粉蚧、雙條拂粉蚧、杰克貝爾氏粉蚧、大洋臀紋粉蚧、木槿曼粉蚧、甘蔗粉蚧和木瓜粉蚧等8種粉蚧的DNA模板進行擴增和電泳檢測，結果如下(圖1)：該引物只能針對新菠蘿灰粉蚧擴增出552 bp大小的片段，而對其它粉蚧不具有擴增能力，表明所設計的D.ne-F/D.ne-R為新菠蘿灰粉蚧種特異性引物。

圖1 用D.ne-F/D.ne-R特異性引物對新菠蘿灰粉蚧及近緣種擴增的結果Fig.1 The amplification result of Dysmicoccus neobrevipes and its related species using specific primer D.ne-F/D.ne-R注：M：分子標記，1，2，3為新菠蘿灰粉蚧；4，5，6為扶桑綿粉蚧；7，8，9為雙條拂粉蚧；10，11，12為杰克貝爾氏粉蚧；13，14，15為大洋臀紋粉蚧；16，17，18為木槿曼粉蚧；19，20，21為甘蔗粉蚧；22，23，24為木瓜粉蚧。Note: M: DNA Maker, 1, 2, 3: Dysmicoccus neobrevipes; 4, 5, 6: Phenacoccus solenopsis Tinsley; 7, 8, 9: Ferrisia virgata Cockerell; 10, 11, 12: Pseudococcus jackbeardsleyi; 13, 14, 15: Planococcus minor Maskell; 16, 17, 18: Maconellicoccus hirsutus; 19, 20, 21: Saccharicoccus sacchari Cockerell; 22, 23, 24: Paracoccus marginatus.

2.2 新菠蘿灰粉蚧種特異性引物對不同蟲態和不同稀釋倍數模板DNA檢測

以新菠蘿灰粉蚧不同蟲態的DNA為模板，以D.ne-F/D.ne-R為特異性引物進行PCR擴增，該引物對不同蟲態的新菠蘿灰粉蚧都能穩定的擴增出552 bp大小的片段(圖2)；此外，當將單頭成蟲模板DNA稀釋為14 ng/μL、7 ng/μL、3.5 ng/μL、1.75 ng/μL、875 pg/μL、437.5 pg/μL等不同濃度時進行PCR擴增和電泳檢測，結果表明，當稀釋為437.5 pg/μL時，仍然可以有效、特異性地擴增出552 bp大小的片段(圖3)，表明該引物具有較高的靈敏性。

圖2 用D.ne-F/D.ne-R特異性引物對新菠蘿灰粉蚧不同蟲態擴增的結果Fig.2 The amplification result of different developmental stages of Dysmicoccus neobrevipes using specific primer D.ne-F/D.ne-R注：M：分子標記，1，2，3為1齡若蟲；4，5，6為2齡若蟲；7，8，9為3齡若蟲；10，11，12為成蟲。Note: M: DNA Maker, 1, 2, 3: 1st instar; 4, 5, 6: 2nd instar; 7, 8, 9: 3rd instar; 10, 11, 12: adult.

圖3 用D.ne-F/D.ne-R特異性引物對新菠蘿灰粉蚧的最低檢出閾值Fig.3 The minimum threshold for Dysmicoccus neobrevipes using specific primer D.ne-F/D.ne-R注：M：分子標記，1-6分別為14 ng/μL、7 ng/μL、3.5 ng/μL、1.75 ng/μL、875 pg/μL、437.5 pg/μL。Note: M: DNA Maker, 1-6 represent14 ng/μL、7 ng/μL、3.5 ng/μL、1.75 ng/μL、875 pg/μL、437.5 pg/μL.

3 結論與討論

本文通過對新菠蘿灰粉蚧、扶桑綿粉蚧、雙條拂粉蚧、杰克貝爾氏粉蚧、大洋臀紋粉蚧、木槿曼粉蚧、甘蔗粉蚧和木瓜粉蚧等8種粉蚧的ITS序列進行測定，通過序列分析比對，針對新菠蘿灰粉蚧設計出了一對種特異性引物，該引物可以特異性的擴增出552 bp大小的片段，而對其它7種粉蚧沒有擴增能力，能有效快速地鑒定出新菠蘿灰粉蚧；該引物不僅對新菠蘿灰粉蚧的成蟲具有良好的擴增能力，而且對單頭1齡若蟲、2齡若蟲和3齡若蟲也都有同樣的擴增效果；此外，該引物還可以檢測出最低濃度為437.5 pg/μL，具有較強的敏感性。然而由于粉蚧種類較多，有許多種類在本文中未曾涉及，因此，對所設計的新菠蘿灰粉蚧特異性引物尚需要做進一步的檢測。

到目前為止，對粉蚧類昆蟲的鑒別主要是依據其成蟲外部形態特征，但粉蚧類昆蟲是外部形態十分相似的一類害蟲，有些種類鮮見雄蟲，可供比較的形態學特征是有限的，而且有些形態分類特征并不穩定，如有些粉蚧的個體大小、剛毛的長短和透明孔的有無都可能受外部環境的影響，低齡若蟲形態分類特征更加不穩定(Cox，1983)。近年來，隨著分子生物學技術的廣泛應用，粉蚧類昆蟲的鑒定取得了重大進展。Beuning等(1999)通過獲得Pseudococcusviburni(Signoret)、P.longispinus(Targiono-Tozzetti)、P.calceolariae(Maskell)和P.similans(Lidgett)的ITS序列，并設計特異性引物來對這4種粉蚧進行了分子鑒定，而此特異性引物還可用于成蟲、卵和若蟲等材料的鑒定；徐浪等(2016)利用mtDNA COI基因設計了兩組特異性引物和MGB探針，應用TaqMan實時熒光PCR方法對新菠蘿灰粉蚧和菠蘿灰粉蚧進行了快速準確鑒定；徐浪等(2013)測定了7種粉蚧的COI序列，并與BOLD和Genbank中的DNA條形碼數據庫比對，實現了相關蚧蟲的快速準確鑒定。本文所設計的新菠蘿灰粉蚧種特異性引物能夠不受其發育階段和環境因素制約，準確、簡單、快速的鑒定出新菠蘿灰粉蚧，該技術的建立，將為檢驗檢疫部門提供有效的檢測方法，同時對防治外來粉蚧也具有重要意義。

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MolecularmarkertechniqueforrapididentificationofDysmicoccusneobrevipes(Beardsley)

MA Guang-Chang, WANG Xiao-Ni, NIU Li-Ming, GONG Zhi, WEN Hai-Bo, JIN Qi-An, PENG Zheng-Qiang*

(Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academy of Tropical Agriculture Science, Haikou 571101, China)

Dysmicoccusneobrevipes(Beardsley) is an invasive pest, which tremendously harms economic crops includingAgavesisalanaandAnnonasquamosa. It is very hard to rapidly and accurately distinguishing mealybugs because of their small size and similarity in external morphology. In this study, we had developed a method for the rapid differentiation ofD.neobrevipesby molecular marker technique. Sequences ofD.neobrevipes、PhenacoccussolenopsisTinsley、FerrisiavirgataCockerell、Pseudococcusjackbeardsleyi、PlanococcusminorMaskell、Maconellicoccushirsutus、SaccharicoccussacchariCockerell andParacoccusmarginatuswere analysed. A pair of specific primers which is specific toD.neobrevipeswas designed. A single 552 bp (GenBank accession number: MF 363108) fragment was amplified using the specific primers only inD.neobrevipes. No fragments were amplified using the specific primers in other mealybugs. The amplification ability of specific primer was proved to be capable for not only adults but also 1st, 2ndand 3rdinstar ofD.neobrevipes. Moreover, the assays was capable of detecting 437.5 pg/μL. This technique should be useful tool for pest rapid diagnosis, quarantine and monitoring during transportation of seedlings likeA.sisalana.Keywords:Dysmicoccusneobrevipes(Beardsley); molecular marker; rapid identification; specific amplification

公益性行業(農業)科研專項經費“南繁區生物安全監測預警及控制關鍵技術研究與示范”(201403075)；國家重點研發計劃項目(2016YFC1201200)

馬光昌，男，1981年生，山西人，碩士，助理研究員，研究方向為入侵害蟲生物防治，E-mail：mgc53@126.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: lypzhq@163.com

Received：2017-06-01; 接受日期Accepted: 2017-06-21

Q963；S412

：A

1674-0858(2017)04-0893-05

馬光昌，王曉妮，牛黎明,等.快速鑒定新菠蘿灰粉蚧的分子標記技術[J].環境昆蟲學報，2017,39(4):893-897.