光肩星天牛氣味結合蛋白AglaOBP1的克隆、表達及結合特性

李廣偉，陳秀琳，尚天翠，姚付龍

(伊犁師范學院生物與地理科學學院，新疆伊寧 835000)

光肩星天牛氣味結合蛋白AglaOBP1的克隆、表達及結合特性

李廣偉*，陳秀琳，尚天翠，姚付龍

(伊犁師范學院生物與地理科學學院，新疆伊寧 835000)

利用RT-PCR技術克隆了光肩星天牛AnoplophoraglabripennisMotschulsky氣味結合蛋白(odorant binding proteins，OBPs)基因AglaOBP1(GenBank登錄號：KX660670)，AglaOBP1的開放閱讀框長435 bp，編碼144個氨基酸，其中N端有21個氨基酸組成的信號肽序列，成熟蛋白序列具有4個保守的半胱氨酸殘基，AglaOPB1屬于Minus-C OBP亞家族基因。AglaOBP1主要在成蟲觸角中表達，且雌蟲觸角中的表達量顯著高于雄蟲觸角。重組蛋白AglaOBP1與34種氣味配體的競爭結合實驗表明，AglaOBP1具有廣泛的結合譜，能與五角楓揮發物中的醇類、醛類、萜烯類和酮類物質結合，其中與順-3-己烯-1-醇、順-2-己烯-1-醇、1-己醇、反-2-己烯醛、反-2-癸烯醛、β-石竹烯、(+)-檜烯、α-蒎烯、1-(2,3-二甲基苯基)-乙酮的結合能力較強，結合常數分別為5.88、8.33、12.29、12.55、11.90、7.47、9.07、10.29和13.12 μM。此外，配體的官能團、碳鏈長度、空間構型也影響AglaOBP1對氣味分子的結合。AglaOBP1基因在成蟲觸角中高豐度表達，其重組蛋白能夠與五角楓揮發物的多種組分結合，表明AglaOBP1在成蟲寄主定位選擇中起重要作用。

光肩星天牛；氣味結合蛋白；嗅覺；熒光競爭結合實驗；揮發物

氣味結合蛋白(odorant binding proteins，OBPs)是由嗅覺感受神經元(olfactory receptor neurons)周圍的副衛細胞分泌的一類小分子量的水溶性胞外蛋白。越來越多的研究者認為昆蟲OBPs在選擇性地識別和運輸氣味分子中起著重要作用，OBPs是嗅覺信號傳導途徑中的第一類關鍵蛋白(Klein, 1987; Van den Bergetal., 1991; Kriegeretal., 2002; Xuetal., 2005; Laughlinetal., 2008)。根據氨基酸序列中半胱氨酸殘基的數量，將昆蟲OBPs分為Classical OBPs、Minus-C OBPs和Plus-C OBPs三類(Hekmat-Scafeetal., 2002)。目前，對鞘翅目昆蟲OBPs的研究主要集中在嗅覺相關基因的鑒定、組織表達分析及進化關系方面(Lietal., 2015; Liuetal., 2015; Huetal., 2016)，對OBPs識別、運輸、釋放和降解氣味分子的機制研究相對較少。與鱗翅目昆蟲相比，鞘翅目昆蟲OBPs基因家族組成中Minus-C OBPs所占比例較大，探究Minus-C OBPs的生理功能對解析鞘翅目昆蟲的嗅覺識別機制至關重要。熒光競爭結合實驗是測定OBPs結合氣味分子能力的典型方法，以N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine，1-NPN)為熒光探針，已測定了如鱗翅目、膜翅目、半翅目、直翅目、雙翅目、鞘翅目等多個目約200多種昆蟲OBPs的結合功能(Zhouetal., 2004; Gongetal., 2007; Vandermotenetal., 2011; Zhangetal., 2011; Dengetal., 2012)。

光肩星天牛AnoplophoraglabripennisMotschulsky是我國林木上重要的一種毀滅性蛀干害蟲，國內主要分布于甘肅、陜西、內蒙古、山西、河南、河北、遼寧等省區。自2002年在新疆伊寧市發現光肩星天牛危害以來，已對當地的主要樹種如楊、柳、槭、榆、五角楓等造成嚴重的危害。光肩星天牛以幼蟲營鉆蛀危害，生活隱蔽，化學防治效果較差。面對日益嚴重的防控壓力，探索防治光肩星天牛的新方法、新技術是目前亟待解決的難題(王愛靜等，2010)。光肩星天牛雖然寄主廣泛，但成蟲對寄主植物有明顯的取食和產卵偏好，如明顯喜好取食五角楓的嫩梢，更偏好在旱柳枝干上產卵，靈敏的嗅覺系統在成蟲寄主定位、產卵場所選擇中起著及其重要的作用(張風娟，2006)。前人已對光肩星天牛幾種主要寄主植物揮發物的組成進行了鑒定，初步獲得了對成蟲有電生理活性和行為活性的組分(李建光，2001；金幼菊等，2004；張風娟，2006；杜和芬等，2016)，同時也對光肩星天牛成蟲觸角中的相關基因進行了鑒定(Huetal., 2016)。本文以光肩星天牛成蟲嗜食寄主五角楓的主要揮發物為氣味配體，通過測定重組蛋白AglaOBP1與氣味配體的結合能力，探索AglaOBP1在光肩星天牛嗅覺通訊系統中的生理功能。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

供試蟲源采自新疆伊寧市，寄主植物為市區綠化樹種五角楓。將光肩星天牛幼蟲危害的五角楓枝條截至50-80 cm長的短枝，裝入紗網(30目)系緊袋口并噴水保濕，待成蟲羽化后將雌雄分開并飼喂五角楓嫩枝補充營養。成蟲置于人工氣候箱內飼養，溫度26℃±1℃，相對濕度40%-60%，光周期15 ∶9(L ∶D)。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1主要試劑

RNAiso Plus、Ex Taq酶、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒SYBRRPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)、DNA 2000 Marker、低分子量蛋白Marker、克隆載體pMD?19-T、限制性內切酶EcoR I和Hind III購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自Omega公司；表達載體pET28a(+)、感受態細胞DH5α和BL21(DE3)購自全式金生物科技有限責任公司；Ni-NTA His·Bind Resin純化樹脂購自七海復泰生物科技有限公司；熒光探針1-NPN購自TCI，其他試劑均為分析純。

1.2.2主要儀器

PCR儀(GeneAmp PCR system 9700，Gene limited company)；實時熒光定量PCR儀(iQ5，Bio-Rad)；熒光分光光度計(日立F-4500，日本經營電子電器有限公司)；核酸蛋白濃度測定儀(SimpliNano，GE)；全波長酶標儀(Bio-Tek，Biotek公司)。

1.3RNA提取及cDNA第一鏈合成

為測定氣味結合蛋白基因的組織表達譜，收集5日齡雌雄成蟲的不同組織(觸角、頭、胸、腹、足和翅)。其中觸角、翅和足各20對，頭和胸各10枚，腹5枚，每個樣品重復3次。將收集的樣品立即置于用液氮冷卻的小型研缽中研磨，參照Trizol法提取樣品的總RNA，RNA濃度及OD260/OD280值用核酸蛋白濃度測定儀測定，RNA的完整性用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將質量合格的總RNA用DNase I去除基因組DNA后用Oligo(dT)18引物和MMLV反轉錄酶合成第一鏈cDNA，-80℃保存備用。

1.4 PCR擴增

以光肩星天牛觸角cDNA為模板，根據觸角轉錄組測序注釋獲得的候選AglaOBP1基因序列設計特異性引物擴增編碼區(見表1)。PCR反應體系：10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTP(10 mM)0.5 μL，MgCl2(25 mM)2 μL，正向引物(10 mM)1 μL，反向引物(10 mM)1 μL，cDNA模板1 μL，Ex Taq 0.3 μL，ddH2O 16.7 μL。PCR擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，PCR循環數35個；72℃延伸10 min，PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將目的片段純化后與克隆載體pMD?19-T連接，涂板培養后隨機選擇5個陽性質粒菌液測序驗證。

表1 PCR擴增和原核表達AglaOBP1基因所用引物

1.5 序列分析

利用在線程序Open Reading Frame Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)預測OBP基因的開放閱讀框(ORF)；SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測信號肽序列；Primer premier 5軟件翻譯蛋白質序列，在線軟件Expasy(http://web.expasy. org/protparam/)分析蛋白的理化性質，采用ClustalX 1.8.3進行序列同源比對。

1.6 AglaOBP1基因組織表達譜分析

利用qRT-PCR測定AglaOBP1基因在不同組織中的相對表達量，以Aglaactin1基因(登錄號：KX660673)為內參，實時熒光定量PCR所用的特異性引物見表1。反應體系：SYBRRPremix Ex TaqTMII(2×)10 μL，PCR正向引物(10 μmol/L)0.5 μL，PCR反向引物(10 μmol/L)0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O水補足至20 μL。利用試劑盒說明書推薦的兩步法進行擴增：95℃預變性30 s；95℃ 10 s，61℃ 30 s，共40個循環。反應后進行熔解曲線分析，以排除非特異性PCR產物的污染，空白對照模板以超純水代替cDNA，每個樣品3次生物學重復和3次技術重復，利用2-△△Ct法計算AglaOBP1在不同組織中的相對表達量，AglaOBP1在雌、雄蟲中表達量的差異顯著性用t檢驗檢測。

1.7 AglaOBP1的原核表達及蛋白純化

根據光肩星天牛AglaOBP1的編碼序列及表達載體pET28a(+)設計帶有限制性酶切位點的特異性引物(見表1)。以雌蟲觸角cDNA為模板進行PCR擴增，將擴增產物純化、回收后連接至克隆載體pMD?19-T并轉化DH5α感受態細胞。將測序正確的陽性重組質粒pMD?19-T/AglaOBP1和表達載體pET28a(+)分別進行酶切，并將目的片段與pET28a(+)表達載體相連接，測序驗證后將重組表達質粒pET28a(+)/AglaOBP1轉入BL21(DE3)感受態細胞進行表達。原核表達，蛋白變性、復性和純化參照Li等(2016)的方法進行。純化的重組蛋白經透析、超濾濃縮、BCA法測定濃度后，加入終濃度1 mM DTT和40%甘油后在-20℃保存備用。

1.8 重組AglaOBP1與氣味配體的結合能力測定

(1)測定重組蛋白AglaOBP1與熒光探針1-NPN的結合常數。將低溫凍存的AglaOBP1蛋白溶液用20 mM Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液稀釋至2 μM的測試濃度，1-NPN用色譜級甲醇溶解至1 mM的儲存液。然后向2 μM的蛋白溶液中依次加入1-NPN儲存液，使其終濃度以2 μM的梯度增加，直至蛋白與1-NPN的結合達到飽和，分別記錄每個梯度下產生的最大熒光強度值。采用Prism軟件及Scatchard方程計算重組蛋白與1-NPN探針的結合常數(K1-NPN)。

(2)測定重組蛋白AglaOBP1和氣味配體的解離常數。向2 μM的重組蛋白AglaOBP1溶液中加入1-NPN至濃度為2 μM，在相同的激發光、發射光狹縫寬度(均為10 nm)和波長下記錄激發的最大熒光強度值，再以2，4，6，8，12，16，20，24和28 μM的濃度梯度加入氣味配體，記錄熒光強度值的下降情況。當熒光強度值減弱至初始熒光值的一半時所添加的氣味濃度即為熒光強度中濃度(IC50)。蛋白與氣味配體的解離常數由方程：Ki=[IC50]/(1+[1-NPN]/K1-NPN)計算得出，其中[1-NPN]表示與重組蛋白未結合的1-NPN的濃度，K1-NPN表示1-NPN與重組蛋白的結合常數。

2 結果與分析

2.1 AglaOBP1基因的克隆及序列分析

對光肩星天牛觸角轉錄組測序、注釋獲得的候選氣味結合蛋白基因AglaOBP1進行克隆，通過DNA測序校正了轉錄本組裝及拼接中出現的錯誤堿基，最終獲得了該基因的完整編碼序列，并將基因序列提交至NCBI數據庫，GeneBank登錄號為：KX660670。AglaOBP1的開放閱讀框長435 bp，編碼144個氨基酸，N-端有21個氨基酸組成的信號肽序列(圖1)，AglaOBP1預測的分子量為15.99 kDa，等電點4.76。

圖1 AglaOBP1的核苷酸序列和推導的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequences and deduced aa sequences of AglaOBP1注：起始密碼子和終止密碼子用方框表示，預測的信號肽用下劃線表示，4個保守的半胱氨酸殘基用藍色底紋的圓圈表示。Note: The initiation and termination codons are indicated in boxes, the predicted signal peptide at the N-terminus is underlined, and the four conserved cysteine are marked by a circle with a blue background.

2.2 AglaOBP1多序列比對分析

選取光肩星天牛相同科內物種云斑天牛Batocerahorsfieldi、松墨天牛Monochamusalternatus及其他遠緣物種棕櫚象甲Rhynchophoruspalmarum、大猿葉甲Colaphellusbowringi、山松大小蠹Dendroctonusponderosae、苜蓿盲蝽Adelphocorislineolatus、中黑盲蝽Adelphocorissuturalis、綠盲蝽Apolyguslucorum和蘋果巢蛾ArgyresthiaconjugellaOBP的氨基酸序列進行比對發現，AglaOBP1具有4個保守的半胱氨酸殘基，第2、5位的半胱氨酸分別被蘇氨酸和谷氨酸所取代(圖2)，在序列結構上屬于Minus-C OBP亞家族基因，保守半胱氨酸殘基的分布符合C1-X30-S-X3-C3-X37-C4-X10-E-X8-C6的特征。以AglaOBP1的核苷酸序列為Query序列，Blastx搜索發現AglaOBP1與松墨天牛OBP12(MaltOBP12)的序列相似度最高，達74.0%；與MaltOBP1和MaltOBP22的相似度次之，分別達42.0%和46.0%。與其他昆蟲OBPs的相似性較低，均低于40%。

2.3 AglaOBP1基因的組織表達分析

以光肩星天牛Actin1基因為內參，雌、雄蟲腹部的表達量為參照，qRT-PCR檢測結果表明，AglaOBP1在成蟲不同組織中均有表達，但在觸角中的表達量最高，顯著高于其他組織(P<0.05)(圖3)。AglaOBP1在雌蟲觸角中的表達量分別是頭、胸、腹、足和翅表達量的3.92、17.80、4.07、89.18和68.87倍。AglaOBP1在雌蟲觸角、頭部的表達量明顯高于雄蟲(P<0.05)。鑒于AglaOBP1在成蟲主要的嗅覺器官觸角中高豐度表達，推測其主要的生理功能與感受、識別信息化學物質有關。

圖2 AglaOBP1與其他昆蟲OBPs的多序列比對Fig.2 Sequence alignment of OBPs form Anoplophora glabripennis and other insects

圖3 qRT-PCR分析AglaOBP1在成蟲不同組織中的表達Fig.3 qRT-PCR analysis of AglaOBP1 expressed in different tissues注：*表示同一組織之間雌雄蟲的表達量差異達到顯著水平。Note: *Indicated significant difference in expression level of AglaOBP1 in the same tissues of both sexes.

2.4 AglaOBP1重組蛋白的表達及純化

利用帶限制性酶切位點的特異性引物成功擴增到去信號肽的AglaOBP1編碼區序列(圖4 A)，然后轉化連接到pMD?119-T克隆載體，并分別利用酶切和DNA測序得到驗證(圖4 B)，將目的片段與表達載體pET28a(+)連接后成功轉入BL21感受態細胞并進行誘導表達，通過優化蛋白表達條件(IPTG濃度、誘導溫度、轉速、培養瓶體積)后經SDS-PAGE檢測表明重組蛋白始終以包涵體的形式存在。通過鹽酸胍變性，胱氨酸、半胱氨酸及稀釋復性后獲得了有生物活性的可溶蛋白，經親和層析柱純化后，獲得大小約16 kDa的單一蛋白條帶(圖5)，BCA法測定重組蛋白的濃度為0.87 mg/mL。

2.5 AglaOBP1與氣味配體的結合能力

重組AglaOBP1蛋白溶液自身無明顯的熒光現象。當以2 μM濃度梯度的1-NPN滴定稀釋后的蛋白溶液時，蛋白溶液在410 nm左右產生強烈的熒光現象。隨著1-NPN濃度的不斷增大，熒光強度值的增幅逐漸減小，最終激發熒光達到峰值后不再變化，蛋白溶液與1-NPN呈現出飽和效應。以1-NPN濃度及對應的最大熒光強度值進行非線性回歸分析，計算出重組蛋白AglaOBP1與1-NPN的結合常數為7.65 μM(圖6)。

圖4 AglaOBP1基因擴增及克隆質粒的酶切鑒定Fig.4 PCR amplification of AglaOBP1 gene and digestion analysis of clone plasmidA，AglaOBP1基因去信號肽的編碼區擴增；B，克隆質粒pMD?19-T/AglaOBP1的酶切鑒定。A, PCR amplification of AglaOBP1 gene without signal peptide sequence; B, Digestion analysis of clone plasmid pMD?19-T/AglaOBP1 with restriction enzyme.

圖5 重組蛋白AglaOBP1誘導表達的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE electrophoretic analysis of expressed recombine AglaOBP1注：M,蛋白分子量標準；1,未誘導的pET28a(+)/AglaOBP1復合物；2,誘導的pET28a(+)/AglaOBP1重組蛋白；3,pET28a(+)/AglaOBP1重組蛋白上清；4,pET28a(+)/AglaOBP1重組蛋白包涵體；5,純化的pET28a(+)/AglaOBP1重組蛋白。Note: M, Standard protein marker; 1, Noninduced pET28a(+)/AglaOBP1; 2, Induced pET28a(+)/AglaOBP1; 3, Supernatant of the induced pET28a(+)/AglaOBP1; 4, Inclusion body of induced pET28a(+)/AglaOBP1; 5, The purified protein of pET28a(+)/AglaOBP1.

圖6 AglaOBP1/1-NPN的結合曲線及Scatchqrd方程Fig.6 Binding curves of 1-NPN and relative Scatchard plots for recombinant AglaOBP1

圖7 重組AglaOBP1與五角楓主要植物揮發物的競爭結合曲線Fig.7 The competitive binding curves of AglaOBP1 to host plant volatiles

氣味配體Ligands分子量Molecularweight分子式Formula純度(%)PurityIC50(μM)Ki(μM)醇類Alcohols順?3?己烯?1?醇Cis?3?Hexen?1?ol10016C6H12O980(AR)665588順?2?己烯?1?醇cis?2?Hexen?1?ol10016C6H12O>920(GC)9428331?己醇1?Hexanol10218C6H14O>980(AR)13901229α?松油醇α?Terpineol15425C10H18O980(AR)27562437芳樟醇Linalool15425C10H18O>980(GC)16781484葉綠醇Phytol29653C20H40O>980(GC)--醛類Aldehydes反?2?己烯醛(E)?2?Hexenal9815C6H10O980(AR)14191255己醛Hexanal10016C6H12O>950(AR)16221435庚醛Heptanal11418C7H14O970(AR)14961323癸醛Decanal15626C10H20O970(AR)20091777反?2?癸烯醛(E)?2?Decenal15425C10H18O95013451190十二醛Dodecanal18432C12H24O95020321797十四醛Tetradecanal18428C11H20O2980--酯類Esters乙酸乙酯Ethylacetate8811C4H8O2≥997(GC)27342418乙酸環己烯酯Cyclohexenylacetate14018C8H12O296019351711乙酸?順?3?己烯酯(Z)?3?Hexenylacetate14220C8H14O2>970(GC)19951764丙酸?順?3?己烯酯(Z)?3?Hexenylpropionate15622C9H16O297029182581鄰氨基苯甲酸?順?3?己烯酯cis?3?Hexenylanthranilate21928C13H17NO2>980(GC)18871669丁酸?順?3?己烯酯(Z)?3?Hexenylbutyrate17025C10H18O298027342418異丁酸?順?3?己烯酯(Z)?3?Hexenylisobutyrate17025C10H18O2970--己酸?順?3?己烯酯(Z)?3?Hexenylhexanoate19830C12H22O2980--萜烯類Terpenoidsα?蒎烯α?Pinene13623C10H16980(AR)1026907 + ?檜烯 + ?Sabinene13623C10H16≥98511641029α?羅勒烯α?Ocimene13623C10H16≥900(AR)14191255β?水芹烯β?Phellandrene13623C10H16>650(GC)--β?月桂烯β?Myrcene13623C10H16>900(GC)21481900(?)?檸檬烯(?)?Limonene13623C10H16>950(GC)19351711β?石竹烯β?Caryophyllene20435C15H24>900(GC)845747α?法尼烯α?Farnesene20435C15H24mixtureofisomers22121956

續上表

氣味配體Ligands分子量Molecularweight分子式Formula純度(%)PurityIC50(μM)Ki(μM)烷烴類Alkanes十二烷Dodecane17033C12H26>990(GC)--十三烷Tridecane18436C13H28980--十五烷Pentadecane21241C15H32990--酮類Ketones對乙基苯乙酮4?Ethylacetophenone14820C10H12O>970(GC)233620662，3?二甲基苯基?乙酮2，3?Dimethylacetophenone14820C10H12O98014841312

3 結論與討論

本研究從光肩星天牛觸角中克隆了一種OBP基因AglaOBP1，序列比對發現AglaOBP1屬于OBP家族Minus-C OBP亞家族基因。在天?？评ハx觸角中Minus-C OBP基因種類較多，如李慧(2012)通過構建云斑天牛Batocerahorsfieldi觸角cDNA文庫并結合ESTs測序，獲得9種Minus-C OBPs基因，占鑒定到總OBPs的60%；Hu等(2016)通過轉錄組測序在光肩星天牛觸角中共鑒定到42種OBPs，其中Minus-C OBP占OBPs基因總數的42.5%，且不同Minus-C OBPs序列的相似度較低，在3.3%-55.0%；Gao等(2015)通過構建松墨天牛觸角cDNA文庫和ESTs測序，共鑒定到4種OBPs，其中2種屬于Minus-C OBPs基因。前人通過對不同昆蟲基因組及轉錄組序列所包含的OBP比較發現，Minus-C OBPs更多地存在于比較原始的昆蟲中，而Classical OBPs、Plus-C OBPs更多地存在于較為進化的物種中，昆蟲OBPs向著產生更多半胱氨酸殘基的方向進化(Vieiraetal., 2011)。Minus-C OBPs屬于光肩星天牛觸角氣味結合蛋白的一個大類群，在進化上程度上相對原始，但本實驗的測定結果表明光肩星天牛的Minus-C OBP(AglaOBP1)仍具有識別寄主植物揮發物的功能。

本研究構建了重組表達質粒pET28a(+)/AglaOBP1并在BL21(DE3)表達感受態細胞中成功表達。經過對誘導表達條件的優化，如IPTG濃度、誘導溫度、誘導時間、轉速、培養菌液的容器大小等反復試驗后發現，即使在16℃、160 rpm、IPTG濃度為0.05 mM時，重組蛋白AglaOBP1仍以包涵體的形式存在。通過8 M的鹽酸胍溶解包涵體，考慮到OBPs屬于含有較多半胱氨酸的蛋白，通過依次加入還原劑二硫蘇糖醇(DTT)(10 mM)、胱氨酸(5 mM)、半胱氨酸(5 mM)減少分離獲得的包涵體中含有鏈間形成的二硫鍵和鏈內的非活性二硫鍵，提高了蛋白的復性效果。因為復性的蛋白溶液中含有少量的DTT會還原蛋白純化層析柱中的Ni離子，使鎳離子柱的吸附能力降低。本實驗在純化蛋白之前將復性的蛋白溶液經過透析降低了還原劑的濃度，提高了鎳離子柱的吸附能力，獲得了較高純度且有生物活性的重組蛋白，為測定氣味結合蛋白結合氣味分子的生理功能奠定了基礎。利用以上蛋白變性、復性方法，已成功獲得了如棉鈴蟲(Zhangetal., 2012)、苜蓿盲蝽(Guetal., 2011)、梨小食心蟲Grapholitamolesta(Lietal., 2016)、華北大黑鰓金龜Holotrichiaoblita(莊緒靜，2012)、胡蜂Polistesdominulus(Calvelloetal., 2003)等昆蟲OBP的重組蛋白。

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Cloning,expression,andbindingpropertiesofodorantbindingprotein1fromAnoplophoraglabripennisMotschulsky(Coleoptera:Cerambycidae)

LI Guang-Wei*, CHEN Xiu-Lin, SHANG Tian-Cui, YAO Fu-Long

(College of Biology & Geography, Yili Normal University, Yining 835000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China)

Odorant binding protein geneAglaOBP1 fromAnoplophoraglabripenniswas cloned via reverse-transcription PCR, The sequence ofAglaOBP1 has ORF of 435 bp that encodes 144 amino acids, including signal peptides of 21 amino acids at the N-terminal. The matured protein possessed four conserved cysteine and can classified Minus-C OBP subfamily genes. The results of RT-qPCR showed thatAglaOBP1 was highly expressed in antennae, and the expression quantity in female antennae was significantly higher than that in male antennae. Recombinant AglaOBP1 (rAglaOBP1)was successfully expressed in a prokaryotic expression system and purified via Ni-NTA His·Bind Resin. The results of fluorescence competitive binding assays demonstrated that rAglaOBP1 exhibited broad binding properties and can bind aliphatic alcohols, aldehydes, terpenes and ketones. rAglaOBP1 showed higher binding abilities to Cis-3-Hexen-1-ol, Cis-2-Hexen-1-ol, 1-Hexanol, (E)-2-Hexenal, (E)-2-Decenal, β-Caryophyllene, (+)-Sabinene, α-Pinene, and 2,3-Dimethylacetophenone with theKivalue of 5.88, 8.33, 12.29, 12.55, 11.90, 10.29, 7.47, 9.07 and 13.12 μM, respectively. Besides, the functional group, the length of carbon chain and space isomerism of ligands were all influence the binding affinities of AglaOBP1.AglaOBP1 was highly expressed in antennae, and the recombinant protein showed high binding affinities with components emitted fromAcermono, illuminating AglaOBP1 play an important role in seeking host plants of the adults.

Anoplophoraglabripennis; odorant binding protein; olfactory; fluorescence binding assay; volatiles

新疆維吾爾自治區高?？蒲杏媱濏椖?XJEDU2014S062)；新疆維吾爾自治區自然科學基金(2015211C299)

李廣偉，男，1982年生，甘肅會寧人，博士，助理研究員，研究方向為農業害蟲綜合治理，E-mail：xbbjb2010@sina.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: xbbjb2010@sina.com

Received: 2016-11-13; 接受日期Accepted: 2017-03-12

Q966；S433.5

：A

1674-0858(2017)04-0919-11

李廣偉，陳秀琳，尚天翠,等.光肩星天牛氣味結合蛋白AglaOBP1的克隆、表達及結合特性[J].環境昆蟲學報，2017,39(4):919-929.