印楝素A和印楝素B對棉鈴蟲生長發育的影響

路 偉，李佳琪，鄺鵬昆，肖紹偉，王茂源，郭永超，徐漢虹

(1.新疆農業大學農學院，烏魯木齊 830052；2.華南農業大學亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣州 510642)

印楝素A和印楝素B對棉鈴蟲生長發育的影響

路 偉1**，李佳琪1*，鄺鵬昆1，肖紹偉1，王茂源1，郭永超1，徐漢虹2

(1.新疆農業大學農學院，烏魯木齊 830052；2.華南農業大學亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣州 510642)

為了明確印楝素A和印楝素B生物活性的差異，選用印楝素A和印楝素B對棉鈴蟲生長發育的影響進行了比較研究。結果表明：印楝素A和印楝素B對棉鈴蟲3齡幼蟲具有良好的拒食活性，5 μg/mL處理48 h對棉鈴蟲3齡幼蟲的拒食率分別為85.17%和69.02%。分別用含有藥劑(1 μg/mL)的飼料飼喂棉鈴蟲5齡幼蟲，結果表明：印楝素A和印楝素B能夠明顯抑制棉鈴蟲5齡幼蟲的體重增長，處理14 d后幼蟲的體重分別下降50.28%和43.08%，僅有少量個體化蛹，化蛹率分別為26.67%和13.33%。進一步的羽化結果表明：經印楝素A和印楝素B處理的蟲蛹均未能完成羽化。綜合各階段試驗結果來看，印楝素A和印楝素B的生物活性存在差異，印楝素B對棉鈴蟲生長發育的抑制作用高于印楝素A。

印楝素A；印楝素B；棉鈴蟲；生物活性；作用機理

印楝素(azadirachtin)是從印楝樹種子里提取的一種植物源殺蟲劑，屬于四環三萜類化合物，其化學結構大體可分為十氫化萘和三環呋喃左右兩部分(徐漢虹，2001)，對400多種農、林、衛生害蟲具有拒食、抑制昆蟲生長發育、忌避、胃毒和絕育等生物活性，且害蟲不易產生抗藥性(Morgan，2009)。印楝素是當前世界公認的廣譜、高效的環境友好型殺蟲劑(陳小軍等，2010)。印楝素及其類似物繁多、結構復雜，目前已分離出印楝素A、B、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、O、P、Q 15種印楝素類似物(Kouletal.，2003；Kanokmedhakuletal.，2005；徐漢虹等，2017)，在印楝素10多種類似物中，印楝素A(AZA-A)的含量最高、拒食活性最強(徐漢虹等，2017)。另一個重要成分是印楝素B(AZA-B，3-tigloylazadirachtol)，AZA-B的含量為AZA-A的1/3～1/2(張志祥等，2007)。一般認為印楝素直接或間接地通過破壞昆蟲口器上的化學感受器，刺激其特異性抑制型感覺細胞，或者阻斷對取食刺激物起反應的感受器受體細胞的信號輸入，從而抑制昆蟲的取食行為(Luoetal.，1995；Mordueetal.，1998)；干擾昆蟲內分泌系統，影響促前胸腺激素(PTTH)的合成與釋放，使幼蟲不能正常蛻皮和化蛹而導致死亡(李曉東和趙善歡，1995；Laietal.，2014)。目前國內外對AZA-B的研究較少，本文對比研究了AZA-A和AZA-B對棉鈴蟲Heliothisarmigera生長發育的影響，以期為進一步明確印楝素及其類似物的作用機理提供科學依據。

圖1 印楝素A和印楝素B的化學結構式(徐漢虹，2001)Fig.1 Chemical structural formula of azadirachtin A and azadirachtin B(Xiu HH,2001)

1 材料與方法

1.1 供試材料

AZA-A(純度97.0%)、AZA-B(純度95.2%)均由華南農業大學亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室提供。

1.2 供試昆蟲

敏感品系的棉鈴蟲由中國農科院植物保護研究所棉花害蟲研究組養蟲室室內人工飼料飼養。

1.3 試驗方法

1.3.1拒食活性測定

參考張志祥等(2007)的方法。將新鮮潔凈的常規棉花葉片，用打孔器打成直徑2 cm的葉碟。將AZA-A、AZA-B用丙酮-水(1 ∶3，v/v)配制成5 μg/mL的供試藥液，將葉碟在供試藥液中浸3 s后取出，室溫晾干后將葉碟放入墊有保濕濾紙的培養皿(Φ=9 cm)中，每個皿放入3片葉碟、接1頭饑餓處理6 h的棉鈴蟲3齡幼蟲，每個處理10個重復，超純水作為空白對照。48 h后測定剩余葉面積，計算非選擇性拒食率。非選擇性拒食率計算公式如下：

1.3.2對試蟲體重和化蛹率的影響

選取棉鈴蟲5齡幼蟲，將1 μg/mL AZA-A、AZA-B的藥劑分別添加至飼料中，每個指型管內1頭5齡幼蟲、并放入含有藥劑的飼料，每個處理15個重復。正常飼料作為空白對照。每2 d稱重記錄棉鈴蟲的體重，并觀察棉鈴蟲的化蛹歷期、化蛹率。

1.3.3對試蟲蛹重和羽化率的影響

每2 d稱重記錄棉鈴蟲的蛹重，繼續觀察1.3.2每組處理試蟲的蛹重變化及羽化情況。

2 結果與分析

2.1 AZA-A和AZA-B的拒食活性比較

AZA-A和AZA-B處理48 h后對棉鈴蟲3齡幼蟲的非選擇性拒食活性結果見表1。結果表明：AZA-A和AZA-B對棉鈴蟲3齡幼蟲均表現出良好的拒食活性，在5 μg/mL的劑量下處理48 h，對棉鈴蟲3齡幼蟲的拒食率分別為85.17%和69.02%，與對照處理差異顯著，AZA-A和AZA-B處理之間差異不顯著。

2.2 AZA-A和AZA-B對棉鈴蟲幼蟲體重和化蛹率的影響

試驗結果(見表2)表明，對照組棉鈴蟲5齡幼蟲經過15.67 d的化蛹歷期后蛻皮化蛹，化蛹率達到86.67%。而AZA-A和AZA-B對棉鈴蟲幼蟲的體重增長具有明顯抑制作用，與對照組相比，1 μg/mL劑量處理4 d后，棉鈴蟲5齡幼蟲的體重分別下降33.15%和30.54%；處理14 d后，棉鈴蟲5齡幼蟲的體重分別下降50.28%和43.08%，少量個體死亡，AZA-A對棉鈴蟲體重抑制作用優于AZA-B。與對照組相比，AZA-A和AZA-B處理組化蛹率僅為26.67%和13.33%，大部分高齡幼蟲的發育停滯在幼蟲階段，未能完成蛻皮化蛹，與對照組相比差異顯著。AZA-A和AZA-B處理組中少量的化蛹個體平均化蛹歷期也呈現滯后推遲，分別為17.63 d和18.50 d，說明AZA-B對棉鈴蟲幼蟲化蛹的抑制作用高于AZA-A。

2.3 AZA-A和AZA-B對棉鈴蟲蛹重和羽化率的影響

繼續觀察每組處理試蟲的蛹重變化及羽化情況，試驗結果見表3。結果表明：棉鈴蟲蛹期的蛹重呈逐漸下降的趨勢，對照組棉鈴蟲蟲蛹經過8.56 d羽化，羽化率為75.00%。而AZA-A和AZA-B處理組的蟲蛹均未能完成羽化。

表1 AZA-A和AZA-B對棉鈴蟲3齡幼蟲的非選擇性拒食活性(48 h)

注：采用鄧肯氏多重比較進行顯著性分析(P<0.05)。Note: Duncan’s multiple comparisons were used for significance analysis (P<0.05).

表2 AZA-A和AZA-B對棉鈴蟲5齡幼蟲體重的影響

注：采用鄧肯氏多重比較進行顯著性分析(P<0.05)。Note: Duncan’s multiple comparisons were used for significance analysis (P<0.05).

表3 AZA-A和AZA-B對棉鈴蟲蛹重和羽化率的影響

注：采用鄧肯氏多重比較進行顯著性分析(P<0.05)。Note: Duncan's multiple comparisons were used for significance analysis (P<0.05).

3 結論與討論

在印楝素類似物中，AZA-B的含量和拒食活性低于AZA-A，但兩者在印楝素殺蟲劑中都具有重要的作用。印楝素對鱗翅目、膜翅目、鞘翅目、半翅目、同翅目和纓翅目等400多種農、林、倉儲和衛生害蟲具有拒食、忌避等生物活性(徐漢虹等，2017)。Liner等(1995)研究發現印楝素對大菜粉蝶Pierisbrassicae幼蟲中間的栓錐感覺器的抑制型感受細胞有很強的刺激作用，但是對兩側的栓錐感覺器的蔗糖、氨基酸和芥子糖苷感受細胞沒有作用。Mordue等(1998)發現印楝素及其大部分類似物都刺激了化學感受器的抑制型神經元細胞，并且指出鱗翅目昆蟲草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda、煙蚜夜蛾Heliothisvirescens、灰翅夜蛾Spodopteralittoralis和棉鈴蟲對印楝素的拒食活性與化學感受器的神經活性有關。張志祥等(2007)研究發現AZA-A和AZA-B對小菜蛾Plutellaxylostella、斜紋夜蛾Spodopteralitura3齡幼蟲都具有良好的的拒食活性，拒食率均達80%以上，兩者對棉鈴蟲的拒食活性達到差異顯著水平。Qiao等(2014)利用電生理膜片鉗技術研究了印楝素對果蠅的拒食作用，發現印楝素可以顯著降低果蠅食道下神經節(Suboesophageal ganglion，SOG)Ca2+通道電流的峰值和振幅，并引起SOG興奮性突觸后電流(mEPSCs)頻率的降低，進而抑制SOG的自發乙酰膽堿能的釋放。昆蟲大多數味覺神經元投射于SOG，與取食行為密切相關，推測印楝素通過抑制昆蟲SOG興奮性膽堿能突觸傳遞和Ca2+通道，干擾昆蟲神經中樞系統，從而起到對昆蟲的拒食作用。

印楝素另一主要的作用機理是調節昆蟲生長發育活性，表現為抑制幼蟲生長發育，導致幼蟲體質量減輕、不能正常發育，幼蟲蛻皮受阻而死亡，或蛻皮后形成幼蟲-蛹中間體，造成多種器官畸形而致死(Yanetal.，2012；Laietal.，2014)。Koolman等(1988)通過放射免疫法發現印楝素并不能直接與蛻皮激素受體結合；對前胸腺合成蛻皮激素也沒有直接作用(Barnbyma & Klocke，1990)。說明蛻皮激素合成量的下降很可能是印楝素作用于靶器官后間接調控的結果。Lai等(2014)研究發現果蠅成蟲盤是印楝素的重要靶器官，印楝素通過誘導幼蟲成蟲盤發生細胞凋亡，上調胰島素樣肽dilp8表達，進而降低PTTH的分泌，印楝素可能通過果蠅幼蟲營養-胰島素信號途徑調控蛻皮激素、抑制幼蟲生長發育。

印楝素所引發的生理效應也可能是印楝素作用于細胞生長發育、細胞骨架或其細胞信號通路后引起的效應(Huangetal.，2011；Yanetal.，2012)。Garcia等(1991)發現印楝素A可以抑制長紅獵蝽Rhodniusprolixus細胞的有絲分裂。Huang等(2010)研究發現印楝素可以誘導粉紋夜蛾TrichoplusianiBTI-Tn-5B1-4細胞程序性死亡，并且AZA-A對粉紋夜蛾BTI-Tn-5B1-4細胞增殖抑制率、細胞形態和細胞膜電位的影響大于AZA-B；但AZA-B對細胞核的破損率和破損程度要顯著高于AZA-A，這表明AZA-A和AZA-B在作用機理上具有一定的差異性。Huang等(2011)發現p53蛋白參與了印楝素A對Sl-1細胞周期的阻滯，抑制細胞增殖過程和誘導細胞凋亡，印楝素A通過調控Sl-1細胞中線粒體凋亡通路中Ca2+信號，誘導Sl-1細胞發生凋亡。Shao等(2016)發現印楝素A通過抑制斜紋夜蛾Sl-1細胞信號通路PI3K-AKT-Tor的磷酸化水平而誘導自噬產生，同時通過線粒體途徑激活Caspase-3引發細胞凋亡，且印楝素誘導的自噬信號先于凋亡發生，并通過激活tAtg5分子開關促發細胞自噬向凋亡轉化。

AZA-A和AZA-B雖然結構相似，但在母體分析碳環上C-1、C-3取代基丁烯酯鍵的位置存在差異，環氧環C-11取代基也存在“-H”與“-OH”的不同(張志祥等，2005)。Simmonds等(1995)認為印楝素母體分子碳環上C-7、C-11、C-22和C-23是決定生物活性的關鍵位置，基團取代能明顯影響其活性。體重變化、化蛹率和羽化率是昆蟲生長發育的幾個重要指標，本試驗中AZA-A和AZA-B對棉鈴蟲幼蟲都具有良好的拒食活性，并能夠顯著抑制棉鈴蟲幼蟲的蛻皮發育、化蛹率和羽化率，綜合各階段的試驗結果來看，AZA-B對棉鈴蟲生長發育的抑制作用要高于AZA-A，引起兩者差異的分子生物學機制還有待更深入的研究。

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In order to confirm the bioactivity differences, azadirachtin A and azdirachtin B were used to study the effects on growth and development ofHelicoverpaarmigera. The results showed that: Azadirachtin A and azadirachtin B revealed favorable antifeedant activity against 3rdinstar larvae ofH.armigera, when the 3rdinstar larvae ofH.armigerawere treated with 5 μg/mL of azadirachtin A and azadirachtin B for 48 h, the antifeedant rates were 85.17% and 69.02%. The growing development results showed that azadirachtin A and azadirachtin B can inhibit the growth of 5thinstar larvae ofH.armigeraafter 14 d at 5 μg/mL, and larval weight were decreased by 50.28% and 43.08%, respectively. Only a few individuals completed pupation, pupation rate were 26.67% and 13.33%. The further results showed that the pupae ofH.armigeratreated by azadirachtin A and azadirachtin B were failed to complete eclosion. According to the test results at various stages, the conclusion was that the bioactivities of azadirachtin A and azadirachtin B were different, and inhibition of azadirachtin B on the growth ofH.armigerawas higher than azadirachtin A.

Azadirachtin A; azadirachtin B;Helicoverpaarmigera; bioactivity; mechanism

新疆農業大學大學生創新項目(DXSCX92016001)

路偉，男，1984年生，博士，碩士生導師，研究方向為農藥安全性評價，E-mail：teerakon@sina.com

*并列第一作者：李佳琪，男，1994年生，本科生，E-mail: 458534582@qq.com

Received: 2017-06-23; 接受日期Accepted: 2017-07-17

Q965.9；S448

：A

1674-0858(2017)04-0945-05

路 偉，李佳琪，鄺鵬昆,等.印楝素A和印楝素B對棉鈴蟲生長發育的影響[J].環境昆蟲學報，2017,39(4):945-949.

**通訊作者Author for correspondence, E-mail: teerakon@sina.com

EffectsofazadirachtinAandazadirachtinBonthegrowthanddevelopmentofHeliothisarmigera

LU Wei1**, LI Jia-Qi1*, KUANG Peng-Kun1, XIAO Shao-Wei1, WANG Mao-Yuan1, GUO Yong-Chao1, XU Han-Hong2(1. College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China; 2. State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)