疏肝法對肝郁型MCI患者認知功能、尿8-OHdG及血漿SOD和LPO的影響?

侯俊林，詹向紅，孫前明，關徐濤，劉 永，梁 鶴，閆國立，李 偉(河南中醫藥大學，鄭州 450046)

【臨床基礎】

疏肝法對肝郁型MCI患者認知功能、尿8-OHdG及血漿SOD和LPO的影響?

侯俊林，詹向紅△，孫前明，關徐濤，劉 永，梁 鶴，閆國立，李 偉
(河南中醫藥大學，鄭州 450046)

目的：探討疏肝法對肝郁型MCI患者肝郁程度、認知功能、尿8-OHdG及血漿SOD和LPO的影響。方法：用國際MCI診斷標準和肝氣郁結證癥狀篩選標準篩選40～65歲的肝郁型MCI患者，用肝氣郁結證癥狀程度計分表對患者的肝氣郁結程度進行評測，用MoCA量表和WAIS-RC量表簡式對患者的認知功能進行評測，用ELISA法對患者用藥前后的尿8-OHdG、血漿SOD和LPO進行檢測。結果：與用藥前比較，患者用藥后肝氣郁結證癥狀程度計分降低；MoCA量表的視空間與執行、注意、語言、抽象、延遲回憶、定向及總分均升高，命名得分無明顯改變；WAIS-RC量表四合一簡式的相似性、數字廣度、填圖、木塊圖和總分升高；8-OHdG含量降低，SOD及LPO值無明顯變化。結論：疏肝法能降低肝郁型MCI患者的肝氣郁結癥狀，改善患者的認知功能，降低DNA的氧化損傷是認知功能改善的可能原因。

疏肝法；肝氣郁結；認知功能；氧化水平

輕度認知功能障礙(mild cognitive impairment，MCI)是正常衰老與癡呆之間的過渡狀態[1]。MCI患病率在6.1%～16.1%之間[2-3]，隨年齡的增長，約50%的MCI可進展為癡呆[4]。因此，積極研究MCI對防治癡呆有重要意義。臨床觀察發現，長期情緒調節不良的個體易較早出現認知功能下降。肝郁是情緒調節不良的常見證候，但疏肝法能否改善肝郁型MCI患者的認知功能尚未見報道?！督饏T要略》云：“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾?！惫时狙芯坎捎镁哂惺韪谓庥艚∑⒆饔玫腻羞b丸作為疏肝方藥，觀察疏肝法對肝郁型MCI患者肝郁程度和認知功能的影響，并從衰老生物學角度探討患者認知功能改變的可能原因。

根據現有循證醫學證據，尚無藥物可推薦用于MCI患者[5]，故本研究主要探討疏肝法對患者的影響。逍遙丸是疏肝法的代表方之一，其疏肝解郁效果已得到臨床驗證，所以課題未設陽性對照藥。同時，因MCI患者是癡呆的高危人群，確診后應用安慰劑或不給予藥物治療倫理審查不予批準，故未設立安慰劑組或空白對照組，基于以上原因，本研究選擇作用藥前后的對照。且用藥前知情同意中，已明確告知患者逍遙丸是用來改善肝郁而非認知功能，把安慰劑效應降到最低，因此未設對照組對本研究結果和結論的影響有限。

1 實驗材料

1.1 實驗量表

一般情況及病史調查表；簡易精神狀態檢查量表(Mini-Mental State Examination， MMSE)；蒙特利爾認知評估量表(Montreal Cognitive Assessment， MoCA)；全面衰退量表(Global Deterioration Scale，GDS)；日常生活活動量表(Activity of Daily Living Scale，ADL)；肝氣郁結證癥狀程度計分表；中國修訂版韋氏成人智力量表(Wechsler Adut Intelligence Scale-Chinese Revised，WAIS-RC)。

1.2 實驗試劑

人血漿超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)酶免試劑盒(美國R&D公司，批號14-11)；人血漿過氧化脂質(lipid Peroxide，LPO)酶免試劑盒(美國R&D公司，批號14-11)；人尿8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG)酶免試劑盒(美國R&D公司，批號14-11)。

1.3 主要儀器

SK30臺式多功能高速冷凍離心機(美國Sigma公司)，全波長自動酶標儀(美國熱電)，HPS-250生化培養箱(哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司)。

2 對象與方法

2.1 研究對象

來自2013年7月至2015年1月河南中醫學院一附院、三附院體檢科參加體檢人員及鄭州市莆田、賈崗、磨李等大型社區的志愿者，其中符合要求的患者共47例，2人因身體原因退出，實際參與本項研究者45人。本研究以自愿為前提，履行知情同意手續，并報河南中醫藥大學一附院倫理委員會批準。

2.2 納入標準

①符合國際MCI工作組標準[6]；②神經心理學量表：MMSE得分：文盲>17分，小學>20 分，中學或以上>24分；MoCA得分<26分，若受教育年限≤12年則MoCA得分加1分以校正；GDS為2～3級；ADL得分<26分；③符合肝氣郁結證癥狀篩選標準[7]：A.胸脅乳房少腹脹痛；B.抑郁太息；C.咽有梗阻感；D.痛經、閉經或月經先后不定期；E.脈弦。5項中A、B必備，具有3項或兼有如下1項脾虛癥狀(神疲體倦、納差、腹脹、便溏)，記分在6分以上者。計分標準按癥狀分，胸脅乳房少腹脹痛、抑郁太息、痛經、月經不調、神疲體倦、納差、腹脹7項均有5個等級：無(0分)、輕(1分)、中(2分)、重(3分)、嚴重(4分)；咽有梗阻感、便溏脈弦2項均有2個等級：無或消失(0分)、有(1分)；④年齡在40～65歲之間；⑤每例患者的MCI最終臨床診斷和肝氣郁結證診斷均由兩位相應專業高級職稱臨床醫師分別獨立進行，均符合者方可納入。

2.3 排除標準

不符合國際MCI工作組標準或肝氣郁結證癥狀篩選標準者；不能配合調查及檢測者；頭部腫瘤；存在神經系統疾??；重要臟器病變可能影響腦功能或影響對認知功能的評價；精神疾病病史；活動性癲癇者；癡呆患者；服用影響認知功能藥物者。

2.4 血尿樣品的采集與制備

患者用藥前后分別由河南中醫藥大學一附院體檢中心采血、留尿樣，以乙二胺四乙酸作為抗凝劑，血液混合抗凝劑后離心20 min(2000-3000 r/min)，收集上清液。尿樣以同樣方法離心處理。

2.5 8-OHdG、SOD和LPO的檢測方法

采用酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)對尿8-OHdG、血漿SOD和LPO進行檢測。按試劑盒說明逐級加入稀釋過的標準品50 μL，加入樣本50 μL，封板后置37 ℃生化培養箱中溫育反應30 min，洗滌5次；每孔加入酶標試劑50 μL(空白孔除外)溫育、洗滌；每孔加顯色劑A、B液各50 μL，37 ℃避光溫育15 min，每孔加50 μL終止液。輕輕混勻30 s，15 min內450 nm波長依序測量各孔吸光度并計算樣品濃度。

2.6 藥物干預

逍遙丸組成(河南省宛西制藥股份有限公司，批號140409)：柴胡、當歸、白芍、白術(炒)、茯苓、炙甘草、薄荷、生姜，每次8粒，每日3次，持續用藥3個月。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 肝氣郁結證癥狀程度計分結果

表1顯示，與用藥前比較，患者用藥后肝氣郁結證癥狀程度計分降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 肝郁型MCI患者用藥前后肝氣郁結證癥狀程度計分比較分)

3.2 MoCA和WAIS-RC簡式結果

表2顯示，與用藥前比較，患者用藥后MoCA量表的視空間與執行、注意、語言、抽象、延遲回憶、定向及總分均有所提高，差異有統計學意義(P<0.05)；命名得分與用藥前比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表3顯示，與用藥前比較患者用藥后WAIS-RC量表四合一簡式的相似性、數字廣度、填圖、木塊圖及總分均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 肝郁型 MCI患者用藥前后MoCA結果分)

表3 肝郁型MCI患者用藥前后WAIS-RC簡式粗分比較(，分)

3.3 尿8-OHdG、血漿SOD和LPO檢測結果

表4顯示，與用藥前比較 患者用藥后的尿8-OHdG含量降低(P<0.05)，血漿SOD和LPO值比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表4 肝郁型MCI患者用藥前后尿8-OHdG、血漿SOD、血漿LPO結果

4 討論

目前肝氣郁結證癥狀計分尚無統一標準，本研究采用應用較廣的肝氣郁結證癥狀程度計分表對患者進行評測。結果顯示，患者用藥后的分值低于用藥前，差異有統計學意義，說明疏肝法可以降低患者的肝氣郁結程度。

MoCA是一個對認知功能異常進行快速篩查的評定工具。韋氏成人智力量表(Wechsler Adut Intelligence Scale，WAIS)是當今國際心理學界公認的較好的智力測驗之一，但該量表內容較多，耗時較長，被試難以堅持，故有學者建議用WAIS簡式量表[10]。本研究采用MoCA量表和WAIS-RC四合一簡式對患者的認知功能進行評測。結果顯示，患者用藥后MoCA量表除命名外其余領域得分及總分均升高，WAIS-RC四合一簡式的4項分測驗粗分及合計粗分均提高，說明疏肝法可以改善患者的認知功能。

8-OHdG是公認的DNA氧化損傷標志物[11]。受內外源刺激后，8-OHdG 則作為代謝廢物隨尿液排出體外[12]。研究表明，8-OHdG在中晚期阿爾茨海默病(alzheimer disease，AD)和MCI患者的大腦中含量增高[13]；尿液中8-OHdG的水平與認知功能高低呈負相關[14]。本研究結果顯示，與用藥前比較，患者用藥后尿8-OHdG含量降低，提示疏肝法可減輕肝郁MCI患者DNA的氧化損傷。本研究結果與張俊芳等報道的正常參考值有較大差異，所用檢測儀器不同及被試日照時間等因素可能是造成上述差異的原因[8]，該差異不會對本文結論造成影響。

張銘湘等研究認為，神經性退行病變與自由基代謝失衡有關[15]。SOD作為一種抗氧化酶，其活性高低間接反映機體清除氧自由基的能力。SOD活性降低，氧自由基濃度就會升高，可引起神經細胞代謝紊亂、變性、壞死，進而導致患者認知功能損害[16]。多項研究顯示，MCI患者的SOD活性低于正常對照[17-18]；MCI患者認知功能改善后，血清SOD活性隨之升高[19]。但本研究中患者用藥前后SOD水平未出現顯著差異，可能的原因如下：一是運用疏肝法不能提高肝郁型MCI患者血漿SOD活性；二是因用藥前后2次檢測已相隔3個月，患者又處于自然衰老過程中，所以上述結果提示疏肝法的應用尚不能逆轉自然衰老所致的SOD水平下降。

LPO是不飽和脂肪酸經自由基作用形成的過氧化物。隨著年齡增長，人體清除自由基的能力下降，LPO生成增多導致生物體趨向衰老[20]。Lee LK等發現，與正常組比較MCI組的LPO水平顯著升高[21]?；ㄈ值冗\用增智靈口服液對癡呆患者和記憶障礙小鼠進行干預，發現用藥后患者的社會功能以及小鼠的學習記憶能力均得到一定提升，而兩者的LPO含量則顯著降低[22]。但本研究中患者用藥前后LPO無明顯改變，原因可能是隨著年齡增長，中老年人生成LPO增多，超過了疏肝法降低LPO的能力，也可能是疏肝法不具有直接清除LPO的作用。

肝郁可影響全身氣機通調致臟腑受累，或氣血虧虛、腦失濡養，或痰瘀互結、清竅阻塞，終可使腦之生機下降，引起MCI發生。故課題組提出“肝郁腦衰”假說，即曠日持久的情志不暢、疏泄失職是加速衰老進程中認知功能衰退的重要原因之一，并用逍遙丸對肝郁型MCI患者進行干預以反正該理論。逍遙丸方中柴胡、薄荷、生姜辛散以疏肝；當歸、白芍養血以柔肝；炙甘草益氣補中、緩肝之急；白術、茯苓補土健脾防肝之克。如此配伍既補肝體又助肝用，還可防肝之傳變，能很好地發揮疏肝解郁之效。實驗結果表明，疏肝法能改善肝郁型MCI患者的認知功能、降低DNA的氧化損傷是其可能的原因。上述研究結果從一定程度上反證了“肝郁腦衰”假說，為認知功能衰退的中醫藥干預提供了新思路，為肝主疏泄和七情內傷賦予了新認識，為中醫衰老理論增添了新內涵。

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Effects of Soothing Liver Therapy on Cognitive Function, 8-OHdG in Urinary and Plasma SOD and LPO in MCI Patients with Liver Qi Stagnation Type

HOU Jun-lin, ZHAN Xiang-hong△, SUN Qian-ming, GUAN Xu-tao, LIU Yong, LIANG He, YAN Gou-li, LI Wei
(HenanUniversityoftraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450046,China)

Objective：To study the effect of Shugan method to liver depression degree，cognitive function，8-OHdG，SOD and LPO in MCI patients with liver qi stagnation. Methods： Use the International diagnostic criteria for MCI and symptoms of liver qi stagnation screening standard to screening 40 to 65 years old MCI patients with liver qi stagnation.Use degree of liver qi stagnation scores table to evaluate patients degree of liver qi stagnation.Use MoCA and WAIS-RC to evaluating patients cognitive function.Use ELISA to detect 8-OHdG，SOD and LPO in patients before and after treatment.Results： Compared with before treatment，after treatment in the patients, score of liver qi stagnation symptom reduced, score of visuospatial execution， attention， language， abstract，delayed recall，orientation and total score of MoCA Scale all increased.Score of name of MoCA Scale did not change significantly.Score of similarity，digit span，mapping，block diagram and total score of WAIS-RC all increased.The content of 8-OHdG decreased.The activity of SOD and the content of LPO had no significant change.Conclusion： Shugan method can reduce symptoms of liver qi stagnation in MCI patients with liver qi stagnation，improve patients cognitive function，reduce oxidative damage to DNA is the possible causes of the improve of patients cognitive function.

Shugan method; Liver qi stagnation; Cognitive function; Oxidation level

國家自然科學基金資助項目(81173148)-基于肝疏泄理論探討情志對衰老進程中認知功能的影響及機制；國家自然科學基金資助項目(81473556)-疏肝法對情緒調節不良MCI患者工作記憶影響的機制研究；河南中醫藥大學博士科研基金項目(BSJJ2011-08)-孔圣枕中丹對MCI患者認知功能和ERP成分的影響

侯俊林(1981-)，男(蒙古族)，河南鎮平人，講師，醫學博士，從事情志與衰老相關疾病的理論及臨床研究。

△通訊作者：詹向紅(1963-)，女，河南許昌人，教授，醫學博士，博士研究生導師，從事情志與衰老相關疾病的理論及應用研究，Tel：0371-65962406，E-mail：zxh371@163.com。

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