紅外光譜法快速預測不同種類重樓中重樓皂苷含量

吳喆　張霽　張金渝　徐福榮　王元忠

[摘要] 重樓皂苷是中藥重樓主要的有效成分，為了快速評價重樓品質，保證重樓在臨床治療中的療效，本文采用紅外光譜結合偏最小二乘回歸法（partial least squares regression，PLSR）對重樓中重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ和重樓皂苷Ⅶ進行定量分析，建立快速評價重樓品質的方法。采集78份不同產區、不同種類重樓樣品的紅外光譜，用高效液相色譜測定重樓樣品中重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ及重樓皂苷Ⅶ的含量，將重樓的紅外光譜數據和液相數據進行擬合，快速預測3種重樓皂苷含量。原始紅外光譜經多元散射校正（multiplicative signal correction，MSC）、標準正態變量（standard normal variate，SNV）、正交信號校正（orthogonal signal correction，OSC）、一階求導（first derivative，1st Der）、二階求導（second derivative，2nd Der）預處理后，運用偏最小二乘回歸分析建立重樓皂苷的定量預測模型。重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅱ的最佳預處理方法為MSC+OSC+2nd Der，重樓皂苷Ⅶ的最佳預處理方法為MSC+SNV+OSC+2nd Der；重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ和重樓皂苷Ⅶ 3個指標成分定量校正模型的決定系數（R2）分別為0.930 8，0.934 8，0.912 3 mg·g-1；校正均方根誤差（root mean square error of estimation，RMSEE）分別為1.855 0，0.632 3，0.001 6 mg·g-1；驗證模型的決定系數（R2）分別為0.948 8，0.963 6，0.780 1 mg·g-1；預測均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）分別為1.704 6，1.227 7，0.001 9 mg·g-1；定量模型的預測值與真實值比較接近，模型預測效果好，其中重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ定量模型效果優于重樓皂苷Ⅶ。該方法無損、快速、準確，可用于重樓中重樓皂苷含量的快速測定。

[關鍵詞] 重樓； 紅外光譜； 定量分析； 重樓皂苷； 偏最小二乘回歸

Rapid prediction of the content of polyphyllin in various species of

Paris by infrared spectrometry

WU Zhe1，2， ZHANG Ji2， ZHANG Jinyu2， XU Furong1*， WANG Yuanzhong2*

（1. College of Traditional Chinese Medicine， Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China；

2. Institute of Medicinal Plants， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650200， China）

[Abstract] Polyphyllin is the main active constituent in Paris which was a traditional Chinese medicine. In order to evaluate the quality of Paris rapidly and ensure the efficacy in clinical therapy， we quantified the contents of polyphyllin Ⅰ， polyphyllin Ⅱ and polyphyllin Ⅶ using infrared spectroscopy with partial least squares regression（PLSR）. The method for evaluating the quality of Paris was established. Infrared spectra of 78 samples from various species in different origins were collected. The contents of polyphyllin Ⅰ， Ⅱ and Ⅶ were determined by high performance liquid chromatography（HPLC）. The HPLC data were combined with the spectral data to predict the contents of three polyphyllin rapidly. Multiplicative signal correction（MSC）， standard normal variate（SNV）， orthogonal signal correction（OSC）， first derivative and second derivative were utilized for the spectral preprocessing. Then， the optimized spectral data were used to establish the quantitative prediction model based on PLSR. The results showed that the best spectral pretreatment of polyphyllin Ⅰ and Ⅱ were MSC+OSC+2nd Der and that of polyphyllin Ⅶ was MSC+SNV+OSC+2nd Der. In the quantitative calibration model， the determination coefficients （R2） of polyphyllin Ⅰ， polyphyllin Ⅱ and polyphyllin Ⅶ were 0.930 8， 0.934 8 and 0.912 3， respectively while the Root mean square error of estimation（RMSEE） were 1.855 0， 0.632 3 and 0.001 6 mg·g-1， respectively. In the verification model， the R2 of polyphyllin Ⅰ， polyphyllin Ⅱ and polyphyllin Ⅶ were 0.948 8， 0.703 6 and 0.801 7， respectively， and the root mean square error of prediction（RMSEP）were 1.704 6， 1.227 8 and 0.002 0 mg·g-1， respectively. Because of the predictive value of quantitative model was closed to the real value， the effect of the model was good. The model of polyphyllin Ⅰ and Ⅱ were better than that of polyphyllin Ⅶ. The developed method was nondestructive， fast， and accurate. It was feasible to determine the content of polyphyllin in Paris.endprint

[Key words] Paris； infrared spectroscopy； quantitative analysis； polyphyllin； partial least squares regression

優質的中藥材是保證中藥在臨床療效中安全性和有效性的前提，中藥質量控制與評價是保證中藥的安全性和有效性的重要手段[1]。中藥的質量決定著現代中醫藥的發展，對其進行質量控制及品質評價是目前中醫藥研究的熱點[2]，因此尋找科學、有效、全面和實用的中藥質量控制與評價方法是亟需解決的難題。

在中藥質量評價領域，有效成分的含量檢測主要用高效液相色譜法和氣相色譜法，以上方法均存在樣品前處理復雜、耗時長、儀器操作繁瑣等缺陷。中藥有效成分在檢測的過程中，不穩定的化合物易通過光照、受熱、受潮等發生一系列的光解、氧化或水解反應，使化合物內部結構發生改變，故前處理復雜及分析時間長易導致檢測準確度降低[3]。近年來，紅外光譜定量分析技術因其操作簡單、快速、無損等優勢在食品[45]、農業[6]、化工[7]以及醫學[89]領域迅速發展。此外，在中藥質量評價方面也得到了廣泛的應用，如采用近紅外光譜法結合偏最小二乘回歸建立了定量模型，對人參中總皂苷含量進行預測，結果顯示，近紅外光譜法結合化學計量學可為人參質量控制提供一種新方法[10]；Shao等[11]采用紅外光譜結合高效液相法建立了白術中白術內酯Ⅰ，白術內酯Ⅲ的偏最小二乘定量校正模型，交叉驗證顯示模型預測效果好；雷敬衛等[12]以枳實中辛弗林、醇提物的高效液相色譜法和熱浸法所測含量作為參考值，運用近紅外光譜技術結合化學計量學方法建立枳實中辛弗林及醇提物的定量分析模型，并用未知樣品進行驗證，結果顯示該方法準確、簡便、快速，可用于枳實中辛弗林和醇浸出物含量的快速預測。

重樓為百合科植物云南重樓Prais polyphylla Smith var. yunnanensis（Franch.）Hand.Mazz.或七葉一枝花P. polyphylla Smith var. chinensis（Franch.）Hara的干燥根莖，秋季采挖，除去須根。重樓作為云南白藥、宮血寧膠囊、季德勝蛇藥片的主要原料藥之一，已廣泛應用于臨床治療[13]。2015年版《中國藥典》對重樓的質量控制已做出明確規定，按干燥品計算，重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ和重樓皂苷Ⅳ的總量不少于0.60%[14]。由于重樓皂苷含量的高低直接影響重樓藥材的質量，評價其含量對藥用植物重樓具有重要意義。本文采用傅立葉紅外光譜結合偏最小二乘回歸建立了藥用植物重樓中3種皂苷的定量分析模型，為重樓藥材的皂苷含量測定提供了一種新方法，同時為快速評價重樓品質提供參考和依據。

1 材料

78份重樓藥材由云南省農業科學院藥用植物研究所張金渝研究員鑒定為百合科植物白花重樓、云南重樓、多葉重樓、凌云重樓、毛重樓、南重樓、七葉一枝花、球藥隔重樓、五指蓮、西疇重樓、狹葉重樓、長藥隔重樓的干燥根莖，樣品來源詳見表1。樣品粉碎后，過80目篩，置于自封袋中備用。

Frontier型傅立葉變換紅外光譜儀（Perkin Elmer， USA）；LCMS8030型超高效液相色譜儀（Shimadzu， Japan）；XS125A型電子分析天平（Precisa，Switzerland）；FW100型高速粉碎機（華鑫儀器廠）；80目標準篩盤（道墟五四儀器廠）。

對照品重樓皂苷Ⅰ（批號14010711）、重樓皂苷Ⅱ（批號14022211）、重樓皂苷Ⅵ（批號14011203）、重樓皂苷Ⅶ（批號14011203）購自中國食品藥品檢定研究院，甲醇（色譜純，美國Fisher試劑公司），乙腈（色譜純，美國Fisher試劑公司），甲酸（分析純，天津市風船化學試劑三廠），水為自制超純水。

2 方法

2.1 紅外光譜的采集

取1.5 mg樣品與100.0 mg溴化鉀在瑪瑙研缽中充分混合研磨后加入模具壓成均勻薄片，采集樣品紅外光譜圖。實驗條件：光譜掃描范圍4 000～400 cm-1，掃描信號累加16次，分辨率為4 cm-1，每個樣品掃描2次，取平均光譜，掃描時扣除H2O和CO2的背景。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ各1.0 mg，分別加入甲醇充分溶解，定容至10 mL量瓶中，搖勻，避光，4 ℃保存備用。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取重樓粉末約0.1 g，置具塞試管中，加80%甲醇2 mL，常溫下超聲提取40 min，冷卻至室溫，即得備用。

2.3 色譜條件

根據2015年版《中國藥典》一部中重樓皂苷高效液相色譜檢測方法改良后進行測定。色譜條件：Shimpack XRODS Ⅲ column（2.0 mm×75 mm，1.6 μm）色譜柱，流動相為乙腈（A）0.05%甲酸水（B），柱溫為45 ℃，進樣量為1 μL。梯度洗脫0～1.5 min，17%A；1.5～4.0 min，17%～23%A；4.0～8.7 min， 23%A；8.7～18 min， 23%～38%A；18～25.6 min，38%～60%A；25.6～28.2 min，60%～17%A；

平衡4 min后進行下一次進樣。不同種類重樓色譜圖，見圖1。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍 精密吸取重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ對照品溶液，加入甲醇配制系列濃度的對照品溶液，按照2.3項色譜法進行測定。以峰面積Y為縱坐標，對照品溶液質量濃度X（g·L-1）為橫坐標，分別建立標準曲線，并計算回歸方程，見表2。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ對照品溶液，按2.3項色譜條件下，連續進樣6次，持續3 d。記錄重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ的保留時間和峰面積，計算RSD。結果見表3，保留時間的日內和日間RSD均低于2%，峰面積的日內和日間RSD均低于3.2%，表明方法的精密度好。endprint

2.4.3 重復性試驗 取同一云南重樓樣品粉末0.1 g，按2.2項方法制備供試品溶液，依照2.3項色譜條件進樣測定，記錄重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ的保留時間和峰面積。計算保留時間RSD分別為0.20%，0.11%，0.14%和0.12%，計算峰面積RSD分別為2.1%，2.3%，3.1%，1.1%，表明方法重復性好。

2.4.4 穩定性試驗 取同一云南重樓供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h進樣測定。記錄重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ的保留時間和峰面積，計算保留時間RSD分別為0.070%，0.070%，0.030%，0.030%，計算峰面積RSD分別為1.6%，2.3%，2.3%，3.7%，表明樣品溶液在24 h內穩定。

2.4.5 加標回收率試驗 精密稱取9份云南重樓樣品各0.1 g，分別按80%，100%，120%加入重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ的標準品溶液，計算加標回收率，結果見表4。

2.5 重樓皂苷定量模型

78個重樓樣品的原始譜圖經預處理后，隨機抽取15個作為驗證集，其余樣品作為訓練集，結合偏最小二乘回歸分析（partial least squares regression，PLSR）建立重樓皂苷的定量分析模型。評價模型的主要參數為決定系數（determination coefficient，R2）、校正均方根誤差（root mean square error of estimation，RMSEE）[15]和預測均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）[1617]。其中，R2越接近1，RMSEE和RMSEP值越小，表明定量模型的預測值與高效液相色譜色譜法所測真實值的相關性越強，模型的預測精確度越高[18]。

3 討論與結論

3.1 重樓紅外光譜

78份重樓樣品的原始紅外疊加光譜圖中，其峰位和峰形基本一致，但吸光度間存在明顯差異。3 399，2 930，1 640，1 372，1 153，1 079，1 023，928，577 cm-1為重樓樣品主要特征吸收峰，見圖2。3 500～2 500 cm-1處特征吸收峰主要歸屬于羥基（OH）伸縮振動和烷基中（CH）對稱伸縮振動，3 399，2 930 cm-1分別為OH的振動吸收峰和亞甲基（CH2）的對稱伸縮振動。1 640 cm-1為甾體皂苷中羰基（C=O）的伸縮振動或多糖中OH的彎曲振動。1 372 cm-1為甲基（CH3）對稱彎曲振動[19]。1 200～950 cm-1處特征吸收峰主要為皂苷和淀粉等糖類物質的振動吸收區域[20]，1 153，1 079，1 023，928 cm-1強吸收峰為皂苷類、淀粉和糖苷類（CO）伸縮振動或甾體皂苷中（OH）彎曲振動。1 153，1 079，1 023，577 cm-1主要為多糖（COC）的伸縮振動[20]。

3.2 光譜預處理

實驗過程中，物質的干擾、化學因素、實驗儀器的缺陷都可能產生噪音，樣品表面的色澤、背景顏色和其他因素常會導致光譜出現明顯基線漂移。噪音過大會降低光譜的信噪比、分辨率、準確度和精密度[21]。在對光譜進行分析前，往往利用光譜預處理消除原始譜圖信號基線漂移、光散射等各種干擾和噪音的影響。光譜預處理還能夠將光譜中包含的有效信息充分提取，從而達到提高校正模型預測精確度的目的。多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）用于消除不同樣品表面顆粒大小或顆粒分布不均產生的散射影響，從而消除因散射而導致基線偏移和偏移的現象[2223]。光譜求導處理可以解決基線漂移的影響，有效區分重疊的譜帶并將細微的差異放大，提高光譜的分辨率和靈敏度從而達到凈化圖譜的作用[24]。正交信號校正（orthogonal signal correction， OSC）是在建模之前，將光譜陣與濃度陣進行正交處理，濾除兩者不相關的正交主成分，再進行定量分析[2526]。OSC能夠通過剔除與目標變量無關的干擾信息提高光譜分析的準確度。標準正態變量（standard normal variate，SNV）可以計算指定光譜總變量的標準偏差，利用該標準偏差值將所有光譜標準化，從而達到消除斜率變化和校正光散射影響[27]。

本文利用SIMCAP+11.5軟件對原始光譜圖進行一階求導（first derivative，1st Der）、二階求導（second derivative，2nd Der）、MSC、OSC和SNV等預處理。重樓皂苷Ⅰ的最佳預處理方法為MSC+OSC+2nd Der，提取前3個主成分時累計貢獻率達到了93%；重樓皂苷Ⅱ的最佳預處理方法為MSC+OSC+2nd Der，提取前8個主成分時累計貢獻率達到了93%；重樓皂苷Ⅶ的最佳預處理方法為MSC+SNV+OSC+2nd Der，提取前5個主成份時累計貢獻率達到91%，見表5。

3.3 重樓皂苷HPLC測定

不同種類重樓樣品中重樓皂苷含量，藥用植物重樓中重樓皂苷的含量存在較大差異，其中五指蓮含重樓皂苷Ⅰ最高為（18.854±5.578） mg·g-1，但含重樓皂苷Ⅶ含量較低僅為（0.001±0.001） mg·g-1；狹葉重樓含重樓皂苷Ⅶ最高為（0.015±0.003） mg·g-1，而重樓皂苷Ⅱ未檢出；含重樓皂苷Ⅱ最高的是長藥隔重樓達到6.118 mg·g-1，見表6。在HPLC色譜法測定含量過程中，60份樣品中重樓皂苷Ⅵ的含量值均未檢出，故重樓皂苷Ⅵ在以下分析中不再做進一步研究。

3.4 重樓皂苷預測模型的建立及驗證

原始紅外光譜存在大范圍的譜帶重疊現象，僅從圖譜中難以獲知重樓皂苷含量與吸光度之間的關系?；瘜W計量學方法可以有效的解決譜帶重疊的現象[28]，并可作為紅外光譜圖與重樓中指標性成分含量的橋梁，通過化學計量學方法將光譜數據轉換為定量模型，便能夠通過光譜信息預測出重樓中指標性成分的含量[29]。PLSR為最常用的定量分析多元校正法，能夠克服數據共線，譜帶重疊、噪音等問題[30]。PLSR基于雙線性多變量關系將X矩陣（紅外光譜數據）和Y矩陣（HPLC測定值）相關聯[3133]，并最大化X與Y矩陣間的協方差，利用新的潛在變量解釋X矩陣的可變性，同時根據Y與X矩陣間的線性關系對Y矩陣進行解釋[34]。endprint

重樓樣品紅外原始光譜數據經預處理后，隨機抽取15份樣品為驗證集，其余63份樣品為訓練集。將訓練集樣品的紅外光譜數據與高效液相色譜法檢測的皂苷含量值相結合，分別建立重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ和重樓皂苷Ⅶ的PLSR定量回歸模型， 見圖3。結果顯示，訓練集樣品均勻的分布在回歸線兩側。通過最佳光譜預處理后，重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ和重樓皂苷Ⅶ的R2分別為0.930 8將15份驗證集樣品的紅外光譜數據導入所建的定量模型，對驗證集樣品進行定量預測，從而驗證模型的準確性。重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ和重樓皂苷Ⅶ的R2分別為0.948 8， 0.963 6， 0.781 0；RMSEP分別為1.704 6， 1.227 7， 0.001 9 mg·g-1，重樓樣品中各重樓皂苷的真實值與預測值相關圖， 見圖2。重樓樣品中各指標成分含量的紅外光譜預測值與HPLC法測定的真實值相關性好，利用紅外光譜建模預測重樓中重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ以及重樓皂苷Ⅶ含量是可行的。與重樓皂苷Ⅰ， Ⅱ的驗證模型相比，重樓皂苷Ⅶ的模型預測效果更低，這可能是樣品中重樓皂苷Ⅶ的含量較低，導致訓練模型和驗證模型的相關性較低[35]。

4 結論

重樓中重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ和重樓皂苷Ⅶ是目前評價重樓品質的主要依據。本文利用偏最小二乘回歸將紅外光譜和高效液相色譜數據進行擬合，建立了重樓中主要指標成分的PLSR模型。紅外光譜經MSC+OSC+2nd Der處理后，重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅱ模型的預測效果最佳；紅外光譜經MSC+SNV+OSC+2nd Der處理后，重樓皂苷Ⅶ的預測效果最佳；重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ的PLSR模型效果優于重樓皂苷Ⅶ。本研究的重樓樣品來自不同的產區且種類豐富，故利用其紅外光譜所建立的PLSR模型具有代表性。利用紅外光譜分析技術結合PLSR建立重樓主要指標成分的定量分析模型，該方法彌補了傳統含量檢測方法耗時、費力等缺陷，可用來快速、準確評價藥用植物重樓的質量。

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[責任編輯 丁廣治]endprint