青海鵝觀草屬10個野生種質資源酯酶同工酶分析

李淑娟+李長慧+張英+劉艷霞

摘要：采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳（PAGE）技術對青海鵝觀草屬10個野生種質資源進行酯酶同工酶（EST）檢測和分析。結果表明，鵝觀草屬10個種質的酯酶同工酶譜帶共有9條，形成4個區域（A、B、C、D），其中Rf值為0.198、0.469、0.630的這3條酶帶為共有帶，其余則為各份材料的特征帶；各種質材料間的酯酶同工酶表現出較豐富的多態性，說明鵝觀草屬10個種質不同種及部分種的不同居群在遺傳本質上是有區別的。聚類分析表明，鵝觀草屬10個野生種質資源可聚為3個類群。

關鍵詞：鵝觀草屬；種質資源；酯酶同工酶；聚類分析

中圖分類號： S543+.202文獻標志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0024-03[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-12-24

基金項目：青海省科學技術應用基礎研究計劃（編號：2014-ZJ-712）。

作者簡介：李淑娟（1967—），女，青海貴德人，碩士，教授，主要從事牧草種質資源與遺傳育種研究。E-mail：lsjqhu@163.com。

[ZK）]

鵝觀草屬（Roegneria C. Koch）為小麥族（Trit-iceae Dumortier）近緣屬中植物種類最多的多年生大屬，現有120多種，我國有70多種[1]。該屬許多物種是草原或草甸的組成成分，而且許多種類可作為優良牧草加以利用，也有部分種類含抗逆基因，可作為麥類作物培育新品種的寶貴資源。目前僅青海省鵝觀草屬植物就有23種、3個變種，廣泛分布于三江源、祁連山地的大部分地區。其中的多數種具有抗寒、耐旱、耐鹽堿、耐貧瘠等優良特性，是高寒地區天然草場的重要組成成分和優良的牧草，也是高海拔地區人工草地建設、草地改良、水土保持以及生態環境建設的首選草種。然而，鵝觀草屬植物種間由于形態特征較為相似，可作為分類依據的器官結構較為細微，其分類在禾本科中一直屬于難度較大的屬。

同工酶是一種特異蛋白質，是基因的直接產物，同工酶的差異反映基因的表達差異[2]。同工酶作為一種便捷的分子標記，廣泛應用于生物學研究的各個領域，如探討物種的起源進化、了解植物居群的遺傳結構、研究種內遺傳多樣性等，在植物的種群、發育及遺傳研究中，尤其對其種間分類及親緣關系的研究有重要意義[3-9]。采用同工酶分析技術對種間、品種間的分類研究已比較廣泛，其方法、技術較為成熟。從目前的研究來看，尚未有學者對于分布在青海地區的鵝觀草屬植物從生化水平上進行研究。本研究采用酯酶同工酶技術對分布于青海三江源區的鵝觀草屬10個野生種質資源6種[玉樹鵝觀草（Roegneria yushuensis）、毛穂鵝觀草（Roegneria trichospicula）、短柄鵝觀草（Roegneria brevipes Keng）、曲芒異芒草（Roegneria abolinii var. divaricans Nevski）、紫穂鵝觀草（Roegneria purpurascens Keng）、肅草（Roegneria stricta Keng）]及部分種的4個居群進行酶酯同工酶譜帶特征分析，從生化水平探討不同材料間的遺傳差異，為該屬材料的選擇利用及親緣關系判定提供科學依據，這也是對該生態草種進行深入研究及合理開發利用的基礎。

1材料與方法

1.1供試材料

本試驗所采用的鵝觀草屬10份野生種質材料種子均采自青海三江源地區，于2015年5月種植于青海大學農牧學院草業科學系牧草試驗田，待供試材料生長至幼苗期采集幼葉作為試驗材料。其編號、物種名稱及采集地等信息見表1。

1.2方法

1.2.1酶提取液制備分別稱取10個試驗材料的葉片（幼葉）各1 g，洗凈后用濾紙吸干水分，剪碎后置于預冷的小研缽中，加入少量提樣緩沖液，在冰浴中研磨勻漿，移入離心管中，10 000 r/mim、4 ℃，離心15 min，取0.5 mL上清液，加入等量的樣品處理液，于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2不連續聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳（PAGE）電泳采用不連續聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳技術[10]，分離膠濃度為7.5%，緩沖液pH值為8.8，濃縮膠濃度為3%，緩沖液pH值為6.8，凝膠厚度為1.5 mm。電極緩沖液為Tris-Gly緩沖液（pH值 8.3），上樣量每槽為20 μL。電泳時，電流20 mA，濃縮膠電壓為200 V，分離膠電壓為220 V，溫度4 ℃左右，恒壓電泳至溴酚藍遷移到距凝膠末端1.0 cm處為止。

1.2.3染色、固定及照相電泳結束后，采用醋酸萘酯-固蘭RR鹽染色法染色[11]，室溫下染色至酶帶清晰為止，用水漂洗終止染色，用7%冰乙酸固定5 min，清水漂洗后觀察結果并拍照記錄。

1.2.4酶帶分析及數據處理根據相對遷移率Rf繪制模式圖并標定酶帶位置[12]：

Rf=酶帶的遷移距離/前沿指示劑（溴酚藍） 的遷移距離。

根據同工酶膠板上的譜帶分布確定帶的有無，并轉化成二項數據，在同一Rf值處，有譜帶的記為1，無譜帶的記為0。把同工酶譜信息處理為0、1數據后，采用NTSYSpc-2.10s 統[CM（25]計軟件用非加權組平均法（UPGMA）[13]分析10份材料的酯酶同工酶連鎖類群，構建酶譜聚類樹狀圖，進行聚類分析。

2結果與分析

2.1酶帶及酶譜分布特征

譜帶的數量、出現位點是判斷區分不同種和品種的直觀依據。由圖1、表2可知，供試的10個種質材料的酯酶同工酶酶譜共55條酶帶，鵝觀草屬10個種質的酯酶同工酶譜帶共有9條，形成4個區域（A、B、C、D），每份材料顯示的酶譜帶5～6條不等。把它們分成A、B、C、D 4個區，其中A區為慢速遷移區，有1條酶帶，Rf值為0.198；B區為中速遷移區，酶帶數2～3條不等，Rf值在0.259～0.469之間；C區為較快速遷移區，Rf值為0.630，也僅有1條酶帶；D區為快速遷移區，酶帶數1～2條不等，Rf值在0.765～0.889之間。endprint

由圖2可以看出，10 個種質材料中種間酯酶同工酶酶譜具有一定的差異，主要表現在酶帶數、酶帶遷移率、酶帶的活性強度上。A、B、C區內都有各自的公共帶，其中A1、B4、C1是10 個種質材料的共有帶，酶帶相對穩定，酶活性較強，其余酶帶則為各份材料的特征帶，說明酯酶同工酶譜帶表現出較強的多態性。A區的公共帶Rf=0.198，B區的公共帶Rf=0469，C區的公共帶Rf=0.630。從總體趨勢看出，D區酶的活性最強，其次是B區，C區的活性最弱。

從同種的不同居群間酶譜來看，同為玉樹鵝觀草的R1、R5 2個居群各自的酶帶數、酶帶遷移率及酶帶的活性均大致相同，R2在B1位點表現有特征帶，與R1、R5的酶譜有差異，表明在遺傳上存在分化；同為短柄鵝觀草的R6、R9 2個居群的酶帶數相同，但酶帶的活性不同，R6僅D2 1條強帶，R9有2條強帶，其酶活性及含量均強于R6；曲芒異芒草R3、R7 2個居群酶帶數相同，R3有2條強帶，在D3位點有特征帶，R7只有1條強帶，R3、R7的酶譜有明顯差異?？梢钥闯?，各種間不僅酶帶總數不同，而且在各個區域分布的位點、帶級也明顯不同，而同一物種的不同居群間酶譜既具有較穩定的相似性，又具有細微差異。

2.2酯酶同工酶酶譜相似系數聚類

從表3可以看出，鵝觀草屬10個種質資源的遺傳相似系數在0.167～1.000，其中R1與R5的相似系數最高，說明它們的相似性最高，基本沒有遺傳分化；而R3與R9的相似系數最低，僅為0.167，說明它們的相似性最低，二者的親緣關系很遠。所有樣品在聚類距離約0.65處可分支為3個類群，分別記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類；在第Ⅰ類群中，R1、R2、R4、R5、R10親緣關系一致；在第Ⅱ類群中，R6、R7、R9親緣關系較近；在第Ⅲ類群中，R3、R8親緣關系較近（圖3）。

3討論與結論

魏秀華等利用同工酶技術研究鵝觀草屬的3個物種的生物系統關系，解決了這3個物種的劃分問題[14]。本研究中鵝觀草屬的曲芒異芒草（R3）與玉樹鵝觀草（R2）、毛穗鵝觀草（R4）、短柄鵝觀草（R6）及紫穗鵝觀草（R10）在酯酶同工酶譜帶上存在不同程度的差異，各種間不僅酶帶總數不同，而且在各個區域分布的位點及帶級也明顯不同，其遺傳一致度較低（0.167～0.333）。玉樹鵝觀草的2個居群（R1、R5）及短柄鵝觀草的2個居群（R6、R9）的遺傳一致度很高（1000），但酶帶的活性具有一定的差異性。同為玉樹鵝觀草的R2居群則與其他2個居群（R1、R5）在譜帶分布上也有所不同，遺傳相似度為0.833。居群之間具有相同或不同的酶帶數，或者遷移率之間差異很小，可以認為它們既有共同的遺傳基礎，而且隨著時空的變化又有變異的表現。這與前人的相關研究結果相似，即種子植物屬內種間的遺傳一致度約為0.67，種內居群間的遺傳一致度約為0.90[15]。

基于遺傳相似系數的酶譜樹狀聚類結果顯示，種源相同、地理位置分布較近、海拔近似的鵝觀草屬植物如R1、R2、R4、R5、R10聚為一類；曲芒異芒草的2個居群R3、R7并未聚在一起，而是海拔較高的R7（3 200 m）與R6、R9聚為一類，海拔較低的R3（2 500 m）、R8（2 700 m）2個居群聚為一類。說明鵝觀草屬植物的聚類與種源地、海拔、生境有一定關系，海拔差異小的居群遺傳距離也較小。

鵝觀草屬10個種質資源的酯酶同工酶酶譜類型豐富，酶帶數量、帶級、位點及活性強度等表現出一定差異，各自具有特征譜帶，且所具有的共有帶的帶級、酶含量、活性強度也不盡相同，說明利用這些酶譜特征找出供試材料間的細微差異是可行的，由此表明，供試材料具有獨立的遺傳關系，之間有一定的遺傳分化，是進行生化水平鑒定的有利指標。酶譜分析作為揭示物種遺傳背景的方法，還受生理、發育狀態及人為等因素的干擾，所以應該將其與其他方法包括形態學、細胞學等方法結合起來才能得出更加準確可靠的結果[16]。對該屬植物采用其他種類酶[如過氧化物酶（POD）同工酶、細胞色素氧化酶]分析，尚待進一步研究。

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