肝片形吸蟲囊蚴抵抗力觀察

方 文，李天美，李 婷，陳紹榮，劉榆華，羅家軍

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2017.09.011

肝片形吸蟲囊蚴抵抗力觀察

方 文，李天美，李 婷，陳紹榮，劉榆華，羅家軍

目的觀察肝片形吸蟲囊蚴經加熱、干燥、食用調料等處理后的存活情況。方法將肝片形吸蟲囊蚴經1)加熱：微波高火30 s、60 s；沸水10、30 s和1、2、3 min。 2)干燥：室溫下自然干燥24、40 h。3)食源調料：蒜汁、醬油、醋以及3種等量混合液浸泡10、20、30 min；38°白酒及飽和鹽水各浸泡10、20、30 min。 4)4 ℃下保存10個月。結果2種加熱方式處理后囊蚴全部死亡；放置于玻片上的囊蚴干燥24 h，死亡4只，附著于葉片上的囊蚴干燥40 h，死亡2只；在蒜汁、醬油、醋中浸泡10、20、30 min，囊蚴全部存活；在3種調料的等量混合液、飽和鹽水及38°白酒中浸泡10、20、30 min后，均有部分存活，另有一部分囊蚴結構清晰但蟲體不動，但也無明顯死囊蚴的特征；在4 ℃下保存10個月，仍有存活的囊蚴。結論常用的調料對囊蚴不起作用，自然干燥1～2 d不能完全殺滅囊蚴，在低溫潮濕環境中可較長時間保持活力。沸水加熱10 s或微波高火30 s即可殺死囊蚴。

肝片形吸蟲囊蚴；溫度；調料；抵抗力

片形吸蟲病是一種人獸共患寄生蟲病，以往認為主要是牛、羊等家畜的疾病，只可偶爾感染人體[1-2]。但2011年11月至2012年2月，云南賓川暴發26例大片形吸蟲感染[3-4]，此事件警醒人們：片形吸蟲病是與人們的飲食衛生習慣密切相關的、危害嚴重的食源性(植物源性)寄生蟲病。由于食源性寄生蟲病的傳播和流行是與人們不良的行為方式有關，因此，預防感染的關鍵是開展健康教育活動，向人們宣傳、普及衛生知識，改變不利于健康的生活方式和飲食、衛生習慣，從而提高人們的防病意識和自我保護能力[5-6]。肝片形吸蟲病是因食入含有活的肝片形吸蟲囊蚴的水生植物等而感染，引起的損害主要表現在兩個方面：一是童蟲經小腸、腹腔進入并在肝內移行時造成機械性損傷和化學性刺激，引起肝組織的炎癥反應及肝膿瘍，出現急性癥狀如高熱、腹痛、蕁麻疹、肝腫大及血中嗜酸性粒細胞增多等；二是成蟲進入膽管后引起膽管炎癥、膽管上皮增生及膽管周圍的纖維化[7]。但是，有關片形吸蟲囊蚴對我們日常生活中常見的物理和化學因素的抵抗力的實驗研究較少，本實驗通過對肝片形吸蟲囊蚴經加熱、干燥以及食用調料等處理后，觀察其存活情況，以指導人們采取正確的烹飪方式，預防該病的發生。

1 材料與方法

1.1 肝片形吸蟲囊蚴的培養 肝片形吸蟲蟲卵的收集、孵化等參照本室的方法[8]進行，中間宿主為本實驗室飼養的二代小土蝸。蟲卵孵育至第15天已有大量毛蚴孵出，用吸管將毛蚴吸出于燒杯中，直接倒入養螺盆，進行隨機感染，連續6 d，每次感染的毛蚴數量約600～800條。小土蝸喂食干饅頭(饅頭掰碎、曬干，酌情加入)，每d用去氯水更換養螺水，記錄水溫。感染40 d后，在養螺盆水面放置魚腥草葉片和保鮮膜片(裁成大小為2.5×2 cm)，用來收集囊蚴。

1.2 實驗方法 每項實驗各取10～20只附著于葉片或保鮮膜上的囊蚴：1)經微波高火30 s、1 min后，立即將葉片或膜投入冷水中，以免受高溫持續影響；2) 將盛水的燒杯置于電爐上燒開(當地海拔1 976 km，水的沸點為95 ℃左右)，用鑷子夾住葉片浸入沸水中，分別經10 s、30 s、1 min、2 min、3 min后取出，隨即放入冷水中；3) 室內自然干燥：將囊蚴從保鮮膜上取下置于玻片上，待玻片上的水分蒸發后開始計時24 h；取附著有囊蚴的葉片，待葉片表面上的水分蒸發后開始計時，40 h后置于蒸餾水中，24 h內在鏡下反復觀察；4) 將囊蚴浸泡于飽和鹽水(水溫24 ℃，濃度約33%)、38°白酒、食用醋、醬油(含鹽量15%～20%)、蒜汁及3種調料的等量混合液中，浸泡時間分別為10 min、20 min、30 min，作用時間到后立即取出葉片或膜，用蒸餾水反復清洗，直至清洗液無色、無味，再放入蒸餾水中，24 h內鏡下反復觀察。5) 將囊蚴置于4 ℃下保存10個月，觀察囊蚴的存活情況。

1.3 囊蚴死活判定 實驗終止后，均將最外層囊壁即第一層囊壁去掉，主要觀察第二、三層囊壁及其內幼蟲(即后尾蚴)的變化。死囊蚴：囊蚴變黑；結構不清晰；囊蚴呈圓形或不呈正圓形、幼蟲與囊壁間出現明顯空隙、幼蟲腸盲管結構模糊不清、排泄囊變黑，并在24 h內多次觀察其內的幼蟲仍收縮不動等，均判定囊蚴死亡。實驗終止后，24 h內反復觀察，囊蚴內幼蟲的腸盲管和排泄囊形態清晰，可活動，即判定為活囊蚴。

2 結 果

感染期間水溫為23～27 ℃，平均25 ℃，感染后第44 d檢獲囊蚴。4只小土蝸感染成功，持續24 d逸出尾蚴并結成囊蚴。

2.1 溫度對囊蚴的作用

2.1.1 微波高火30 s和1 min 兩組實驗各做了2次，每次各10只囊蚴。結果囊蚴(圖2)的變化一致，即囊蚴顏色變淺、第二層囊壁變薄，后尾蚴收縮并與囊壁間空隙加大，呈月牙形，最寬處約有10 μm，幼蟲的腸盲管模糊不清，排泄囊變成黑色一團，其上有數十顆如葡萄串樣的屈光顆粒，左右對稱。隨后將觀察過的囊蚴放入蒸餾水中保存，24 h內4～6次吸出反復觀察均未發現幼蟲活動，形態與初次觀察的結果一致，未發生改變。

圖1 正常囊蚴 圖2 微波30 s 圖3 沸水10 s Fig.1 MetacercariaFig.2 Microwave for 30 sFig.3 Boiling water for 10 s

2.1.2 沸水10、30 s和1、2、3 min 5組實驗各做了2次，每次各取10只囊蚴，試驗結果相似(圖3)：囊蚴外形變化不大，顏色呈黑褐色，第二層囊壁變薄，幼蟲收縮與囊壁間出現空隙呈月牙形，在口吸盤對端出現明顯的凹陷，如大腦溝回樣。腸管結構消失或呈絮狀，左右兩側的排泄囊呈黑褐色，其上有數十顆如葡萄串樣的屈光顆粒。在隨后的24 h 內4～6次反復觀察：囊蚴形態均未發生改變，也未發現幼蟲運動。另外，還觀察到一個現象，即實驗所用的囊蚴均是附著在折耳根葉子上，浸泡于沸水中經不同時間后取出，所有囊蚴仍附著在葉上，無一脫落在沸水里。

2.1.3 室內自然干燥 實驗期間室溫在22～24 ℃之間，自然干燥、避免陽光直曬。干燥24 h的結果(圖4)：共有10只囊蚴，其中4只發黑，蟲體結構不清晰；6只形態、顏色、結構與正常囊蚴基本一致，第二層囊壁略呈波浪狀，未發現蟲體運動；保持囊蚴濕潤2 h、5 h后再觀察，結果如前；但17 h后觀察形態未發生改變中的4只可見蟲體運動。

葉片上干燥40 h，此時葉片尚未完全干枯、略軟，取下囊蚴置玻片上觀察，2只變黑，蟲體結構不清；8只形態正常，但未見蟲體運動；保持囊蚴濕潤，5 h后再觀察，可見形態正常中的5只，其內的蟲體可動。隨后，將形態正常的8只囊蚴依次放入人工消化液(38 ℃， 3.5 h)及75%牛膽汁(38 ℃，1.5 h)中，孵出1條后尾蚴(圖5)。

圖4 干燥24 h 圖5 后尾蚴 Fig.4 Drying for 24 h Fig.5 Excited metacercariae

2.1.4 各種調料作用后囊蚴的變化情況 使用日常生活中常用的調料：醋、醬油、蒜汁及3種的等量混合液，以及38°白酒和飽和鹽水，作用時間各為10、20和30 min。結果詳見表1。

表1 調料對肝片形吸蟲囊蚴的影響
Tab.1 Effect of seasonings on F. hepatica metacercariae

調料Seasonings作用時間Time(min)觀察數量(只)Observedquantity結構不清、變黑(只)Unclearstructure結構清晰但不動(只)Clearstructurebutnotmoving結構清晰可運動(只)Clearstructuremovement醋vinegar10100010201000103010046醬油soysauce101000102010001030100010蒜汁garlicjuice101000102010001030100010混合液mixedliquor109045201105630901838°白酒38°liquor10900920100463010055飽和鹽水saturatedbrine1010064208071309072

2.1.5 冷藏保存 因醋、醬油和蒜汁作用過的囊蚴，除了經醋30 min浸泡過的有4只未發現幼蟲運動外，其余全部能活動，因此各收集于小燒杯中加蒸餾水，保存于4 ℃下，10個月后取出觀察，共觀察27只囊蚴：所有囊蚴囊壁結構清晰，而幼蟲結構模糊不清的有8只(如圖6)，幼蟲結構清晰的有13只，其中1只仍可運動(圖7)；另有6只囊蚴因燒杯中水分干涸了約2～3周，加入蒸餾水1 h后觀察，6只的外形正常，內部結構清晰和不清晰各有3只，結構清晰的未發現蟲體運動。

圖6 4 ℃下保存10個月，結構不清 圖7 4 ℃下保存10個月，幼蟲可運動Fig.6 Storing for 10 months at 4 ℃, Fig.7 Storing for 10 months at 4 ℃,unclear structure larval movement

3 討 論

本次所完成的肝片形吸蟲囊蚴抵抗力實驗，是模擬大理地區人們日常生活中經常使用的烹調方法和生活衛生習慣。由于人體感染肝片形吸蟲是食入含活的囊蚴的水生植物等蔬菜而致，這類蔬菜常用來做成涼拌菜，調料主要是醋、醬油、蒜等，一般是將佐料調配好后澆在洗凈切好的菜上，現拌現吃。本實驗采取用上述調料分別浸泡10、20、30 min ，結果表明這些調料單一和混合都起不到殺滅囊蚴的作用。另外，人們認為鹽水和酒可以殺滅寄生蟲卵等微生物，即將蔬菜清洗干凈后，用鹽水浸泡，或者是在進食時以酒佐餐。本次實驗采用濃鹽水(33%氯化鈉溶液)、15%～20%氯化鈉溶液(即為醬油)和38°白酒分別浸泡10、20、30 min ，結果顯示鹽水和白酒也不能完全殺滅囊蚴。雖然在飽和鹽水中浸泡20和30 min后，可觀察到能活動的囊蚴較少，但其內的幼蟲結構并未破壞，由于未做動物感染實驗，因此這樣的囊蚴是否具有感染性尚不得而知。據吳德孚報道[9]，將囊蚴浸泡于6%氯化鈉溶液中6 h，對囊蚴的平均殺滅率為72.1%，但是一般用鹽水浸泡蔬果的時間不會超過20 min。因此，無論是低、中、高濃度的鹽水均不能殺滅囊蚴。

干燥實驗采用兩種方式，一是將囊蚴吸出于玻片上，室溫(22～24 ℃)下自然干燥24 h；另一種方法是模擬人們常用的蔬菜保存方式，即將蔬菜儲存于室內陰涼處1～2 d或更長時間后食用，遂將附著有囊蚴的葉片置室溫下自然干燥40 h。前者明確死亡的囊蚴有4只，后者為2只，表明兩種方式也不能完全殺滅囊蚴。據報道[10]，在溫度20 ℃和相對濕度為98、75、52、33%的環境下，肝片形吸蟲囊蚴保持感染的時間分別為7、7、4、2個月。由于葉子對囊蚴具有保濕作用，這就意味著，在成梱、成堆的蔬菜中，囊蚴存活的時間會更長。

4 ℃水中保存10個月，囊蚴形態正常的占59.26%(16/27)，且其中1只囊蚴仍可運動，表明囊蚴在低溫潮濕的環境中可較長時間保持活力。

但是在高溫下，即微波高火30 s或沸水10 s及以上，囊蚴的形態即可發生明顯改變：蟲體收縮、腸管結構消失或呈絮狀，排泄囊呈黑褐色。在作用結束后24 h內反復觀察，均未發現蟲體運動且形態如初，表明囊蚴不耐高溫。由于本實驗只用單張葉片進行實驗觀察，若在實際烹飪中，應延長加熱時間，使所有蔬菜均勻受熱，以防止感染。另外，附著在葉片上的囊蚴浸泡于沸水中不會脫落在水里，因此盡管沸水10 s即可殺死囊蚴，但是如果是吃火鍋涮菜時，安全起見還是要延長加熱時間。

總之，本次實驗結果表明，肝片形吸蟲囊蚴對日常生活中使用的調料：醋、醬油、蒜汁、鹽，甚至是白酒均不敏感；室溫下自然干燥1～2 d也不能完全殺滅；低溫(4 ℃)潮濕下 ，可長時間保持活力；但囊蚴對高溫敏感，微波高火30 s和沸水10 s，即可殺死。

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ResistanceonFasciolahepaticametacercariae

FANG Wen, LI Tian-mei, LI Ting, CHEN Shao-rong, LIU Yu-hua, LUO Jia-jun

(DaliPrefecturalInstituteofResearchandControlonSchistosomiasis,Dali671000,China)

We observed the survival situation after treatments ofFasciolahepaticametacercariae by heating, drying and food seasoning. Results showed that after treating with microwave high fire and boiling water, all the metacercariae died. There were four metacercariae died after putting on the slide and dried them for 24 hours, while two died after attaching on the blade for 40 hours.The metacercariae all survived in the garlic, soy sauce, and vinegar liquid for 10, 20 and 30 min; After 10, 20 and 30 min soaking in the same amount of mixed liquor of the three kinds of condiments, saturated brine and the liquor of 38°, part of the metacercariae were survival. The rest of the metacercariae showed clear structures, but the bodies did not move with no obvious characteristic of death of metacercariae. Storing for 4 ℃ in the next 10 months, there was still the survival of metacercariae. In conclusion, the commonly used seasoning had no effect on metacercariae. Natural drying for 1-2 days could not completely kill the metacercariae. A low temperature for a long time could maintain vitality. Heating via boiling water for 10 sec or microwave high fire for 30 s could kill metacercariae.

Fasciolahepatica; metacercariae; temperature; seasoning; resistance

云南省大理州血吸蟲病防治研究所，大理 671000；

Email：fangwenee@126.com

R373.2

：A

：1002-2694(2017)09-0809-05

2017-03-23編輯：李友松