臍帶間充質干細胞治療糖尿病腎病大鼠的效果觀察

尤冠巧 張麗娜 陶琳 劉冰

(河南省人民醫院 腎內科 河南 鄭州 450003)

·論著·

臍帶間充質干細胞治療糖尿病腎病大鼠的效果觀察

尤冠巧 張麗娜 陶琳 劉冰

(河南省人民醫院 腎內科 河南 鄭州 450003)

目的觀察臍帶間充質干細胞(UC-MSCs)經體外擴增培養后移植入糖尿病腎病大鼠體內對糖尿病腎病的療效。方法將雄性SD大鼠50只隨機選擇10只為正常對照組，成功制備糖尿病腎病大鼠32只，隨機分為糖尿病腎病組和干細胞移植組。MSCs經體外培養、鑒定、BrdU標記后，將UC-MSCs細胞總數量2×106個通過尾靜脈移植入干細胞移植組大鼠體內，正常對照組、糖尿病腎病組大鼠注射等量無血清的L-DMEM培養基。7 d后再用同樣的方法注射第2次。于末次注射后7、14、21 d測定大鼠血糖、體質量、24 h尿蛋白、肌酐清除率、腎臟肥大指數，觀察大鼠腎臟病理變化和標記干細胞存活情況。結果在各觀察時點，與正常對照組相比，干細胞移植組和糖尿病腎病組血糖、尿蛋白、肌酐清除率、腎臟肥大指數均高于正常對照組(P<0.05)，體質量均低于正常對照組(P<0.05)。在干細胞移植后7 d，與糖尿病腎病組相比，干細胞移植組大鼠血糖降低，差異有統計學意義(P<0.05)，體質量、24 h尿蛋白、肌酐清除率、腎臟肥大指數組間差異無統計學意義(P>0.05)。在干細胞移植后14、21 d，與糖尿病腎病組相比，干細胞移植組大鼠血糖、24 h尿蛋白、肌酐清除率降低，差異有統計學意義(P<0.05)，體質量稍有升高，差異無統計學意義(P>0.05)，腎臟肥大指數降低，差異無統計學意義(P>0.05)。在干細胞移植后21 d，在腎臟組織中可見少量BrdU標記的陽性細胞，糖尿病腎病組腎小球肥大、基底膜增厚，干細胞移植組較糖尿病腎病組有所改善。結論UC-MSCs經體外培養標記后移植入糖尿病腎病大鼠體內，能趨化到糖尿病腎病大鼠的腎臟，且可以一定程度上改善糖尿病腎病。

臍帶間充質干細胞；糖尿病腎??；干細胞移植

糖尿病腎病(DN)是糖尿病常見的慢性并發癥之一，其預防和治療缺乏行之有效的措施。間充質干細胞(MSCs)是一類具有自我更新、多向分化潛能、免疫調節和低免疫原性的細胞。目前有少數動物實驗證實骨髓源MSCs治療糖尿病腎病有效，但臍帶間充質干細胞(UC-MSCs)對糖尿病腎病大鼠腎臟的作用如何尚不可知。UC-MSCs來源豐富，臍帶中免疫系統處于原始狀態，移植后急、慢性移植物抗宿主反應發生率較低，嚴重程度輕，故本研究選用人臍帶制備MSCs治療糖尿病腎病大鼠。

本研究以鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病腎病大鼠為研究對象，以UC-MSCs輸注為干預措施，收集大鼠體質量、24 h尿蛋白定量、血糖、肌酐清除率、標記干細胞體內分布情況、腎臟病理等變化情況資料，觀察UC-MSCs對糖尿病腎病大鼠的治療效果，為UC-MSCs應用于糖尿病腎病提供實證數據和理論依據。

1 材料與方法

1.1試劑STZ購自Sigma公司，胎牛血清(FBS)購自Hyclone公司，L-DMEM培養基購自Gibco公司，BrdU標記及檢測試劑盒購自Roche kit Ⅱ。

1.2UC-MSCs的分離培養和鑒定取足月妊娠剖宮產的新生兒臍帶，利用酶消化法和貼壁法獲得原代細胞，傳4～6代后備用。消化生長狀態良好的細胞，接種一定數量(約2×106細胞/孔)的細胞于petri皿中，每2 d更換1次培養基，分階段誘導14 d后獲得MSCs。誘導體系如下。預分化：L-DMEM+1% 13-巰基乙醇，誘導2 d；第2階段：L-DMEM+100 ng/ml EGF+10 ng/ml bFGF+2%B27，誘導6 d；第3階段：L-DMEM+20 mmol/L尼克酰胺，誘導6 d；對照組培養體系：F12+10%FBS+10 ng/ml bFGF。通過流式細胞儀表面標志鑒定CD34、CD45呈陰性，CD44、CD71、CD105呈陽性，符合MSCs的生長特性。

1.32型糖尿病腎病大鼠模型的建立清潔級雄性SD大鼠，體質量180～200 g。大鼠適應性飼養1周后，2型糖尿病大鼠模型采用RATNA SDANDA提供的方法并適當修改。將實驗動物隨機分為正常對照組(10只)、實驗組(40只)。實驗期間飲水充足，保證正常光照條件。

正常對照組采用普通飲食。糖尿病腎病組采用高糖高脂飲食配方為常規飼料(蛋白質31.10%，脂肪7.79%，其他61.11%)加20%蔗糖、10%豬油、2.5%膽固醇制成。用高糖高脂飼料喂養大鼠4周后，以60 mg/kg的劑量一次性腹腔注射STZ(溶解于新鮮配制的0.1 mol/L檸椽酸緩沖液中，pH值為4.2，濃度0.25%)。3 d后測非禁食血糖，血糖≥16.7 mmol/L為2型糖尿病大鼠模型成模。糖尿病成模后4周，若大鼠尿量>原尿量150%，尿蛋白>30 mg/24 h尿，則糖尿病腎病成模。正常對照組腹腔注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

1.4MSCs的移植用BrdU標記已制備的UC-MSCs。將實驗組造模成功的糖尿病腎病大鼠(32只)按隨機原則分為糖尿病腎病組(16只)和干細胞移植組(16只)。將糖尿病腎病大鼠，用亞致死劑量放射線(300 cGy)照射，照射24 h后，將UC-MSCs細胞總數量2×106通過尾靜脈移植入干細胞移植組大鼠體內，正常對照組、糖尿病腎病組大鼠注射等量無血清的L-DMEM培養基。7 d后再用同樣的方法注射第2次。

1.5移植后療效的檢測分別于MSCs末次移植后7、14、21 d處死大鼠，取大鼠尾靜脈血檢測血糖，同時用大鼠代謝籠留取大鼠24 h尿液，檢測大鼠24 h尿蛋白。尿標本采用大鼠金屬代謝籠收集，大鼠在代謝籠中自由飲食飲水，收集24 h尿量，離心后置于-20 ℃冰箱保存待測。①生化指標測定：血糖檢測采用羅氏羅康全活力型血糖儀；24 h尿蛋白測定采用Olympus AU6000全自動生化分析儀測定；血、尿肌酐測定采用苦味酸法，計算肌酐清除率(ml/min)。②腎臟肥大指數計算：大鼠處死前稱體質量(BW)，處死大鼠后取雙側腎臟，分別稱腎重(KW)，計算腎臟肥大指數=[KW(g)/BW(g)]×103。③腎臟組織病理方法檢測是否有移植MSCs存在：取大鼠右腎組織，冷鹽水沖洗，40 g/L多聚甲醛固定，乙醇脫水，石蠟包埋，制成5 μm石臘切片，分別行HE染色，BrdU免疫組化檢測干細胞在移植大鼠體內分布情況，按照試劑盒要求加入一抗、二抗及鏡下顯色，甘油明膠封片，核呈棕黃色為陽性反應。

2 結果

2.1干細胞移植后療效監測在各觀察時點，與正常對照組相比，干細胞移植組和糖尿病腎病組血糖、尿蛋白、肌酐清除率、腎臟肥大指數均高于正常對照組(P<0.05)，體質量均低于正常對照組(P<0.05)。在干細胞移植后7 d，與糖尿病腎病組相比，干細胞移植組大鼠血糖降低，差異有統計學意義(P<0.05)，體質量、24 h尿蛋白、肌酐清除率、腎臟肥大指數組間差異無統計學意義(P>0.05)。在干細胞移植后14、21 d，與糖尿病腎病組相比，干細胞移植組大鼠血糖、24 h尿蛋白、肌酐清除率降低，差異有統計學意義(P<0.05)，體質量稍有升高，差異無統計學意義(P>0.05)，腎臟肥大指數降低，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2腎臟病理結果正常對照組腎小球未見系膜區基質增多及系膜細胞增生，基底膜未見增厚。見圖1。糖尿病腎病組腎小球發生肥大、呈結節狀硬化、基底膜彌漫增厚、系膜區基質明顯增多。見圖2。干細胞移植組仍可見腎小球體積肥大、基底膜增厚、系膜區基質增多，但較糖尿病腎病組略有改善。見圖3。干細胞移植后3周腎小球內可找到BrdU陽性細胞，主要位于腎間質。見圖4。

表1 干細胞移植后各組大鼠血糖、體質量、尿蛋白、肌酐清除率、腎臟肥大指數比較

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與糖尿病腎病組比較，bP<0.05。

圖1 正常對照組HE圖(×400)

圖2 糖尿病腎病組HE圖(×400)

圖3 干細胞移植組HE圖(×400)

圖4 干細胞移植后3周BrdU免疫組化ABC(×200)

3 討論

干細胞是一類具有自我復制能力的多潛能細胞，在不同條件下，它可以分化成不同功能的細胞。除了胚胎干細胞因倫理等因素受到一定限制外，其他還有3類干細胞，都在進行著廣泛的研究。第一是數量相對最多的存在于骨髓的造血干細胞；第二是臍帶和臍血里有豐富的多種潛能干細胞；還有一少部分在外周血液中，包括少量的造血干細胞、內皮干細胞等。人臍帶中含有許多未成熟的干細胞，具有廣泛的增殖能力和分化潛能。人UC-MSCs不表達或低表達免疫排斥相關標記，免疫原性低，是一類低免疫原性細胞，不須經過嚴格配對使用，異體及異種移植無免疫排斥反應或反應較弱，適宜于不同個體之間的移植。有研究將人來源的臍帶、臍血、骨髓MSCs輸注給SD大鼠、NOD/SCID鼠等均未發生GVHD的表現[1-2]。且人臍帶來源豐富，易得到孕婦及家屬的同意，采集方便，對供者無痛苦、無傷害。因此，本實驗選擇UC-MSCs作為研究對象。

已有一些研究將人UC-MSCs用于不同腎臟病動物模型的研究。張冰等[3]研究發現，人UC-MSCs移植入缺血再灌注誘導的急性腎損傷大鼠，人UC-MSCs可向損傷的腎小管上皮遷移，對腎臟組織起到保護和促進修復作用。李芳等[4]將人UC-MSCs移植入急性腎小管壞死的家犬模型，發現人UC-MSCs移植后可在急性腎小管壞死腎臟內存活，對正常腎臟無影響；對于急性腎小管壞死家犬，人UC-MSCs選擇性存在于腎臟內，對心臟、肝臟及胰腺無影響。湯杰印[5]觀察了人UC-MSCs移植對阿霉素腎病的腎臟保護作用，發現人UC-MSCs移植可改善阿霉素腎病大鼠的臨床及實驗室檢查指標，延緩阿霉素腎病的進展，其機制可能是通過內分泌或旁分泌途徑發揮腎臟保護作用。

少數動物實驗證實，MSCs移植可改善糖尿病腎病動物血糖、保護腎臟功能。Lee等[6]研究表明將MSCs移植給1型糖尿病腎病小鼠后1個月，在腎臟中只發現少量MSCs，提示MSCs分化為腎臟細胞可能不是主要機制。Ezquer等[7]研究表明，MSCs移植后歸巢于NOD/SCID鼠胰島組織，向胰島素分泌細胞分化，改善胰島功能，使血糖和尿糖含量下降，延緩了糖尿病腎病的發生發展。周虹等[8]將大鼠骨髓MSCs應用于糖尿病腎病大鼠的治療，干細胞治療后l周移植組較糖尿病腎病對照組血糖降低；第2、8周移植組較糖尿病腎病對照組24 h尿總蛋白降低；移植組肌酐清除率低于糖尿病腎病對照組；第2周移植組的腎臟肥大指數較糖尿病腎病對照組減少。這提示MSCs經體外培養標記后在體內能趨化到糖尿病腎病大鼠腎臟，可以暫時改善糖尿病腎病。相似研究發現，經尾靜脈注射的骨髓MSCs可定位于2型糖尿病大鼠胰腺及腎臟，并對受損胰腺及腎臟有修復作用，降低血糖，減少尿蛋白排泄，降低血清胰島素水平，提高血清脂聯素含量，改善胰島素抵抗[9]。

人UC-MSCs移植對2型糖尿病腎病大鼠的作用如何呢？本研究發現，在干細胞移植后7 d，與糖尿病腎病組相比，干細胞移植組大鼠血糖、24 h尿蛋白、肌酐清除率、腎臟肥大指數降低，體質量增加。在干細胞移植后14、21 d，與糖尿病腎病組相比，干細胞移植組大鼠血糖、24 h尿蛋白、肌酐清除率、腎臟肥大指數降低，體質量稍有升高。這與周虹等[8]研究結果一致。干細胞移植后21 d，在腎臟可發現少量BrdU標記的陽性細胞，糖尿病腎病組和干細胞移植組較正常對照組腎小球體積明顯肥大、基質增多，干細胞移植組較糖尿病腎病組腎臟病理狀況有所改善。研究結果提示，人UC-MSCs經體外擴增、培養，通過尾靜脈輸注入糖尿病腎病大鼠體內后，能夠歸巢于腎臟組織，并在一定程度上改善糖尿病腎病的癥狀及病理改變。

雖然動物實驗已證實骨髓MSCs治療糖尿病腎病有效，但由于MSCs尚缺乏特異性標志物，各文獻對MSCs鑒定方法不一致，如有以CD29、CD44、CD105等表面標志物陽性，CD34、CD45陰性，對MSCs進行鑒定，亦有應用CD44、CD71、CD105等表面標志物陽性，而CD34、CD45陰性對MSCs進行鑒別。且分離純化技術尚存缺陷，具體哪種干細胞參與腎臟哪些細胞的修復尚不清晰，研究結果可能存在一定差異，所以建立統一的分離體系，建立分離純化的統一標準，可推進干細胞研究的進一步深入。

本研究就人UC-MSCs體外擴增培養移植入糖尿病腎病大鼠體內對糖尿病腎病的療效進行了初步探索，發現UC-MSCs在體內能趨化到糖尿病腎病大鼠腎臟，可以在一定程度上改善糖尿病腎病，為UC-MSCs治療糖尿病腎病提供理論依據，但其作用機制有待更加深入的研究。

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Therapeuticeffectofumbilicalcord-derivedmesenchymalstemcellsondiabeticnephropathyinrats

You Guanqiao，Zhang Lina，Tao Lin，Liu Bing

(DivisionofNephrology，HenanProvincialPeople’sHospital，Zhengzhou450003，China)

ObjectiveTo observe the effect of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) on diabetic nephropathy in rats after transplantation.Methods50 male SD rats were randomly selected 10 rats as normal control group. 32 rats with diabetic nephropathy were successfully prepared and randomly divided into diabetic nephropathy group(n=16) and UC-MSCs transplantation group (n=16). UC-MSCs were cultured, identification, labeled by 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) in vitro, which (cell number 2×106) were then transplanted into the rats of UC-MSCs transplantation group by tail vein. The rats of normal control group and diabetic nephropathy group were injected with equivalent serum free L-DMEM culture medium. The same injection was repeated 7 days later. The blood glucose, body weight, 24 h urinary protein, creatinine clearance rate(Ccr) and profile of kidney hypertrophy(KW/BW) were measured at 7,14,21 days after the last injection. The pathological changes of kidney and the survival of labeled stem cells were observed.ResultsAt each observation point, compared to normal control group, blood glucose, urine protein, Ccr and KW/BW were significantly higher, body weight were lower in UC-MSCs transplantation group and diabetic nephropathy group(P<0.05). After 7 days of transplantation, compared to diabetic nephropathy group, blood glucose was lower in UC-MSCs transplantation group(P<0.05), body weight, urinary protein, Ccr and KW/BW were no significant difference between UC-MSCs transplantation group and diabetic nephropathy group(P>0.05). After 14 days, 21 days of transplantation, compared to diabetic nephropathy group, blood glucose group rats, urinary protein, Ccr decreased in UC-MSCs transplantation group(P<0.05), body weight increased slightly in UC-MSCs transplantation group(P>0.05), KW/BW was decreased in UC-MSCs transplantation group(P>0.05). After 21 days of transplantation, a small of positive cells by BrdU labeled can be observed in the kidney tissues in UC-MSCs transplantation group. Compared to diabetic nephropathy group, the glomerular hypertrophy and basement membrane thickening of the UC-MSCs transplantation group were improved.ConclusionUC-MSCs can track to the kidney of diabetic nephropathy in rats after transplantation, which can improve diabetic nephropathy to some extent.

umbilical cord-derived mesenchymal stem cells；diabetic nephropathy；stem cells transplantation

R 587.2

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.19.001

2017-05-19)

河南省醫學科技攻關計劃普通項目(201303117)。

劉冰，E-mail：Bingliu6699@126.com。