基于物質基礎評價不同干燥工藝對天舒膠囊質量的影響

張夢婷 畢宇安 張欣 徐桂紅 黃文哲 王振中 蕭偉

[摘要]從天舒膠囊所含化學成分的角度，考察熱風循環干燥、噴霧干燥2種干燥方式對天舒膠囊質量的影響，運用UPLCDAD技術首次建立天舒膠囊UPLC 指紋圖譜，并通過UPLCQTOFMS/MS技術對其主要成分進行鑒定，共鑒定出62個化合物，其中21個化合物為首次在天舒膠囊中被報道。實驗表明這2種干燥方式對天舒膠囊中化學成分的種類無影響，但在部分成分的含量上有差別；且以10批熱風循環干燥樣品生成的共有模式作為對照圖譜，噴霧干燥樣品的指紋圖譜相似度為0877，2種干燥方式樣品的指紋圖譜相似程度很高。該研究首次采用UPLCDAD技術結合UPLCQTOFMS/MS技術快速、全面、準確評價不同干燥方式下天舒膠囊化學成分的差異，為天舒膠囊質量評價提供依據。

[關鍵詞]天舒膠囊； 熱風循環干燥； 噴霧干燥； 指紋圖譜； UPLCESIMS/MS； 化學成分

Evaluate effects of different drying methods on quality of

Tianshu capsule on substance basis

ZHANG Mengting1，3， BI Yuan2，3， ZHANG Xin2，3， XU Guihong2，3， HUANG Wenzhe2，3， WANG Zhenzhong2，3， XIAO Wei 1，2，3*

（1. College of Pharmacy， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China；

2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China；

3. State Key Laboratory of Pharmaceutical Process Newtech for Traditional Chinese Medicine， Lianyungang 222001， China）

[Abstract]To investigate the effect of hot air circulation drying and spray drying on the quality of Tianshu capsule from the view point of chemical compositions UPLCDAD was used to establish the fingerprint of Tianshu capsules for the first time， and the main chemical constituents were identified by UPLCQTOFMS/MS A total of 62 compounds were identified in this method， 21 of which were reported in Tianshu capsules for the first time The results showed that there were no significant differences in the identification of the chemical constituents types between these two methods， but the contents of some constituents were different The common patterns generated by the 10 batches of hot air cycle drying samples were used as the control fingerprint， and the similarity of the spray drying samples fingerprints was 0877， with high similarity of the fingerprints between these two methods UPLCDAD combined with UPLCQTOFMS/MS technology was used for the first time to evaluate the chemical constituents of Tianshu capsule rapidly， comprehensively and accurately， providing technical support for the quality evaluation of Tianshu capsule

[Key words]Tianshu capsule； hot air circulation drying； spray drying； fingerprint； UPLCESIMS/MS； chemical components

天舒膠囊作為江蘇康緣藥業股份有限公司獨家生產的中藥六類新藥，來源于金·劉完素《宣明論方》卷二的大川芎方，由天麻、川芎兩味藥材組成，方中川芎和天麻配伍，共奏活血化癖、平肝息風、鎮定止痛之效[1]。臨床主要用于血癖所致血管神經性頭痛，證見頭痛日久，痛有定處，或兼頭暈，夜寐不安，舌質暗或有癖斑。

噴霧干燥及熱風循環干燥作為實際生產中廣泛使用的干燥方式，與熱風循環干燥相比，噴霧干燥的物料受熱時間短、干燥迅速、干燥產物有較好的流動性和分散性[2]。

本實驗首次采用UPLCDAD結合UPLCQTOFMS/MS技術建立一種全面系統的化學評價體系，用指紋圖譜結合化學成分定性研究評價不同干燥方式對天舒膠囊質量的影響，考察不同干燥方式對天舒膠囊化學成分的影響。endprint

1材料

Agilent 1290超高壓液相色譜儀，DAD紫外檢測器，美國Agilent公司；Agilent 1290 UPLC6538QTOF 液質聯用儀，美國Agilent公司；Agilent Masshunter數據處理系統，美國 Agilent公司；Sartorius BT125D電子分析天平，德國 Sartorius 公司；BSA224SCW型電子分析天平，德國Sartorius公司；TG16MW臺式高速離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司； MilliQAcademic純水機，美國 Millipore公司；KQ250DB型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；CTCⅢ型熱風循環烘箱，南京騰飛制藥機械設備有限公司；SODA47型噴霧干燥機，上海大川原干燥設備有限公司。

川芎Chuanxiong Rhizoma（CR，批號Y1607044）為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort的干燥根莖、天麻Gastrodia Rhizoma（GR，批號為Y1608039）為蘭科植物天麻Gastrodial elata BI的干燥塊莖，由江蘇康緣藥業股份有限公司藥材庫提供，由連云港康濟大藥房連鎖有限公司吳舟執業藥師完成鑒定；天舒膠囊，江蘇康緣藥業股份有限公司生產，批號分別為160907，160915，161015，161023，161102，161219，170109，170115，170215，170226；天舒膠囊浸膏（批號170104），江蘇康緣藥業股份有限公司生產；阿魏酸對照品（批號110773201313，質量分數以996% 計）、天麻素對照品（批號110807201507，質量分數以954% 計）、丁苯酞對照品（批號101035201502，質量分數以996% 計）、藁本內酯對照品（批號111737201507，質量分數以100%計）均購自中國食品藥品檢定研究院；巴利森苷A對照品（批號62499289，質量分數≥980%）、巴利森苷B對照品（批號174972793，質量分數≥980%），均購自Shanghai Standard Technology Co. Ltd.；洋川芎內酯A對照品（批號16061406，質量分數以95% 計）購自成都普菲德生物技術有限公司；甲醇，色譜純，美國天地公司；磷酸，分析純；甲酸，色譜純，美國ACS 公司；水為超純水，其余試劑均為分析純。

2方法與結果

21檢測條件

211色譜條件色譜柱為Agilent Zorbax SBC18色譜柱（21 mm × 100 mm， 18 μm），流動相為乙腈（A）01% 磷酸（B），梯度洗脫（0～7 min，1%～3% A； 7～10 min， 3%～7% A； 10～14 min，7%～11% A； 14～202 min，11%～18% A； 202～302 min，18%～28% A； 302～372 min，28%～38% A； 372～602 min，38%～57% A； 602～662 min，57%～73% A； 662～67 min，73%～1% A ； 67～77 min，1% A），柱溫 30 ℃，流速021 mL·min-1，檢測波長230 nm，進樣量08 μL。

質譜分析時色譜條件流動相為乙腈 （A）01% 甲酸 （B），其余條件不變。

212質譜條件電噴霧離子源（ESI），正/負離子模式，掃描范圍m/z 50～3 000；干燥氣流速10 L·min-1；干燥氣溫度 350 ℃；霧化氣壓力310 kPa；毛細管電壓，正離子模式電壓4 500 V；負離子模式電壓 3 500 V，錐孔電壓65 V，碎片電壓135 V；MS/MS分析中的碰撞能根據不同化合物的需要設定在10～40 eV；質譜數據采集的頻率02 s采集1次；儀器分辨率大于2 萬。

22樣品制備

221對照品溶液的制備分別精密稱取天麻素、阿魏酸、藁本內酯、巴利森苷A、巴利森苷B、洋川芎內酯A及丁苯酞適量，用50%甲醇溶解制成 25 mg·L-1的對照品溶液。

222天舒膠囊樣品制備取天舒膠囊內容物，混勻，研細，取10 g，精密稱定，置25 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇稱定質量，超聲處理（功率150 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用50% 甲醇補足失重，搖勻，12 000 r·min-1離心5 min，上清液用022 μm濾膜過濾，取續濾液即得。

223天舒熱風循環干燥樣品制備取天舒膠囊浸膏，以5%含水量為指標，干燥溫度115 ℃ 進行熱風循環干燥，干燥后樣品與相關物料進行制粒。溶液制備方式同222項。

224天舒噴霧干燥樣品制備取天舒膠囊浸膏，參考文獻中噴霧干燥工藝參數[3]，以含水量、干燥粉重為考察指標，最終篩選天舒膠囊浸膏最佳噴霧干燥工藝參數：進風溫度170 ℃，噴樣速度65 r·min-1，出風溫度87 ℃。干燥后樣品與相關物料進行制粒。溶液制備方式同222項。

23精密度試驗

取同一供試品（批號160915）按照222項制備，溶液連續進樣6針，以阿魏酸為參照峰，計算共有峰相對保留時間及主要共有峰相對峰面積，結果RSD均小于50%。又以第1次進樣所得指紋圖譜作為參照計算后5次進樣所得指紋圖譜的相似度，結果相似度結果均不小于099。

24穩定性試驗

取同一供試品（批號160915）內容物適量，按照222項制備供試品溶液，精密吸取08 μL，分別于 0，4，8，12，16，20，24 h 注入液相色譜儀。以阿魏酸為參照峰 （S），計算共有峰相對保留時間及主要色譜峰相對峰面積，結果RSD均小于50%。又以第1次進樣所得指紋圖譜作為參照計算后5次進樣所得指紋圖譜的相似度，結果相似度結果均不小099。endprint

25重復性試驗

取同一供試品（批號160915）內容物適量，按照222項制備供試品溶液，平行制備6份，測定。以阿魏酸為參照峰，計算共有峰相對保留時間及主要色譜峰相對峰面積，結果RSD 均小于50%。又以第 1 次進樣所得指紋圖譜作為參照計算后5次進樣所得指紋圖譜的相似度，結果相似度結果均不小于099。

26指紋圖譜研究

261指紋圖譜的建立與技術參數分別取10批熱風循環干燥生產的天舒膠囊樣品，按222項下方法制備，按211項下色譜條件分別測定，記錄其UPLC圖，見圖1。根據10批樣品色譜圖中各色譜峰的相對保留時間，確定共有峰，選取其中17個共有峰作為特征指紋峰，標記為1～17。將10批所得樣品色譜圖導入由國家藥典委員會主持開發的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件2004 A”中進行相似度分析，生成對照指紋圖譜。以天舒膠囊對照指紋圖譜為參照，計算每批成品指紋圖譜的相似度，本研究分別計算10批樣品的相似度，結果均大于090，見表1。

262指紋圖譜中共有峰的歸屬與指認取同一批天麻藥材、川芎藥材粉末（過3號篩）各約1 g，精密稱定置具塞錐形瓶內，加 50%甲醇25 mL超聲30 min，取續濾液，過022 μm 濾膜，即得。按211項下色譜條件進樣分析，通過保留時間和DAD掃描分析，指紋圖譜中標定的 17個共有峰中 1，2，5，7 號峰來自天麻藥材，3，4，6，8～16 號峰來自川芎藥材，見圖 2。通過與混合對照品圖譜比對，其中2號峰為天麻素，5號峰為巴利森苷B，6號峰為阿魏酸，7號峰為巴利森苷A，14號峰為洋川芎內酯A，15號峰為丁基苯酞，17號峰為藁本內酯。

27不同干燥方式的天舒膠囊樣品的指紋圖譜分析

測定噴霧干燥樣品指紋圖譜并將其導入相似度軟件，計算相似度。指紋圖譜見圖3，圖3中A圖為噴霧干燥的天舒膠囊指紋色譜圖，相似度為0877；B圖為10批熱風循環干燥樣品生成的共有模式作為對照指紋圖譜。從指紋圖譜看出，噴霧干燥與熱風循環干燥的天舒膠囊的指紋相似度相差較小，說明二者所含主要成分的量相差不大，并且直觀表明兩種干燥方式對天舒膠囊化學成分的影響主要在3，6，7，15，17 號峰上。

28不同干燥方式的天舒膠囊主要成分結構解析

281供試品的檢驗采用 UPLCQTOFMS/MS，按21和22項對噴霧干燥和熱風循環干燥方式的天舒膠囊樣品進行化學成分定性分析。

2種干燥方式樣品在正離子和負離子模式下的UPLCQTOFMS總離子流圖示見圖 4，5。從兩圖可以看出，噴霧干燥與熱風循環干燥的天舒膠囊在正負離子模式下均存在一定的差異（如正離子模式下的72，25～27 min處和負離子模式下的18～23 min處），但并不明顯。

282化合物的鑒定與分析通過UPLCESIMS提供的正、負離子模式下準分子離子峰及保留時間，確定相對分子質量，得到可能分子式，利用二級質譜提供的豐富的碎片離子信息，結合對照品信息及質譜裂解規律并查閱相關文獻數據[418]對目標化合物進行鑒定和確證，鑒別出62種化合物，見表2，其中21種化合物是在天舒膠囊中首次被報道出來，主要化合物結構式見圖6。從分析結果可看出，即使總離子流圖中的部分化合物響應值不明顯，一部分化學成分很可能隱藏和包埋在同一個色譜峰的里面，但62種化學成分均能在噴霧干燥和熱風循環干燥的天舒膠囊樣品中被找出，2種干燥方式對天舒膠囊化學成分種類和數量的影響不大。

283天麻苷類化合物天舒膠囊中主要活性成分天麻苷類主要由天麻素及天麻素與檸檬苷類結合而成的巴利森苷類組成[17]。天麻素（Gas）又名對羥基苯甲醇葡萄糖苷，在質譜圖中保留時間為6021 min，分子離子峰是m/z 268，在二級質譜中天麻素酯苷鍵斷裂成對羥基苯甲醇、葡萄糖苷，產生碎片離子峰為m/z 123，161。巴利森苷類為天麻素與檸檬酸類由酯苷鍵結合而成，因此在二級質譜中表現為天麻殘基的相關離子（268，161 ）及檸檬酸的特征離子（173，129，111）。巴利森苷A由3分子天麻素與檸檬苷結合而成，在質譜圖中保留時間為22311 min，分子離子峰是m/z 995，MS/MS 分析中產生m/z 727[M-Gas+H2O]+，459[M-2 Gas+H2O]+等碎片離子；巴利森苷B/C的保留時間分別在18948， 20012 min，分子離子峰均為m/z 726，由2 分子天麻素與檸檬苷結合而成，MS/MS的碎片離子分別是m/z 459[M-Gas+H]+，441[M-Gas+H2O]+等；巴利森苷E保留時間為12269 min，由 1 分子天麻素與檸檬苷結合而成，分子離子峰m/z 460，二級碎片離子峰為m/z 193[M-Gas+H]+，根據MS /MS分析的各成分與對照品及相關文獻對比，推測結果成立。

284川芎苯酞及其二聚體類化合物川芎揮發油由川芎內酯及其二聚體類化合物組成，是天舒膠囊又一重要的活性成分。川芎內酯是具有飽和或不飽和側鏈的苯酞類化合物，其二級質譜特征是從分子離子分別失去飽和或不飽和側鏈的末端烷基-C2H5，-C3H6，-C4H9 等[18]?；衔锉Ａ魰r間分別為11171，41633 min具有相同的質譜數據，質譜中兩者的分子離子峰m/z 204，碎片離子峰m/z 187是分子離子失去酚羥基[M-17]+的碎片峰；m/z 175 峰則是分子離子失去-C3H6[M-42]+同時五元內酯環開裂的結果，碎片離子峰m/z 175 峰則是分子離子失去-C2H5[M-42]+同時五元內酯環開裂的碎片離子峰；m/z 147峰為分子離子失去C2H5 后再失去[CO]，[M-29-28]+的碎片離子，它再經重排失去另1個[CO]形成m/z 119 碎片峰。主要碎片峰m/z 204[M]+，187，175，162，147，119，推斷化合物洋川芎內酯 B、洋川芎內酯 C，因為2個化合物為同分異構體，而洋川芎內酯B的極性比洋川芎內酯C小，在反相柱中，極性大的先出峰，因此保留時間 11171 min為洋川芎內酯C，保留時間41633 min為洋川芎內酯B。endprint

化合物保留時間43703 min的分子離子峰為m/z 278，在質譜圖中，碎片離子峰m/z 249是分子離子失去-C2H5[M-29]+同時五元內酯環結構開裂而成的；分子離子失去-C3H6再失去H2[M-42-2]+同時五元內酯環結構開裂形成碎片離子峰m/z 234；分子離子失去-C2H5后再失去[CO]和H2[M-29-28-2]+對應的分子離子峰m/z 219。根據化合物裂解規律并結合相關文獻推測化合物為川芎內酯M。

保留時間為62221 min分子離子峰m/z 382，一級質譜中m/z 405[M+Na]+，其二級質譜信息主要特征峰為m/z 191[M+H-1/2M]+，其余裂解的碎片峰與藁本內酯相同，推測其為苯酞二聚體化合物，進一步結合文獻推測該化合物為洋川芎內酯P。

保留時間為65126，66120 min 的分子離子峰均為m/z 380，均為苯酞二聚體化合物，一級質譜中m/z 403[M+Na]+，其二級質譜中主要分子離子峰為m/z 191[M+H-1/2M]+，查閱文獻可知化合物可能為riligustilide，tokindide B，levistolide A，由于這三者質譜相似，化合物進一步的鑒定需要其他相關核磁質譜或對照品信息。

285川芎酚酸類化合物川芎酚酸類化合物經證明是天舒膠囊的活性組分，因此用UPLCQTOFMS/MS 分析其主要酚酸類化合物的信息?；衔镌诒Ａ魰r間16324 min分子離子峰為m/z 180，一級質譜中ESI下其準分子離子峰m/z 179[M-H]-，在MS/MS中m/z 179，為準分子離子峰，裂解的主要碎片峰m/z 135[M-H-COOH]-，根據化合物的裂解規律可知此化合物為咖啡酸。

保留時間21851 min的化合物在ESI+下其準分子離子峰m/z 195 [M+H]+，其中m/z 217[M+Na]+，在二級質譜中碎片離子峰m/z 177為失去1分子水的結果[M+H-H2O]+，碎片離子峰m/z 177為苯環上的醚苷鍵斷裂而成[M+H-H2O-CH3OH]+，分子離子失H2O后再失去[CH3OH]和羰基[M-18-32-28]+對應的分子離子峰m/z 117，結合對照品推斷化合物為阿魏酸。

3討論

本實驗首次采用UPLCDAD建立天舒膠囊指紋圖譜的測定方法，并從提取溶劑、提取方式、提取時間、提取溶劑量方面考察了樣品溶液的制備方法；在色譜條件的選擇方面，考察了色譜柱、流動相、洗脫梯度、柱溫、進樣體積，最終選擇合適的色譜條件，所建立的指紋圖譜標定了17個共有峰，更全面準確反映天舒膠囊的化合物信息。

本實驗首次運用UPLCDAD及UPLCQTOFMS/MS技術從指紋圖譜及物質基礎兩方面考察了2種不同干燥方法對產品質量的影響。以10批熱風循環干燥樣品的指紋圖譜生成的共有模式作為對照圖譜，噴霧干燥樣品的指紋圖譜相似度為0877，二者相似程度很高，差異主要在部分指紋峰的響應值；結合正離子和負離子的總離子流圖可發現，噴霧干燥的部分化合物響應值較熱風循環干燥高。采用UPLCQTOFMS/MS 技術對2種干燥方式的產品中的化學成分進行分析鑒別，通過質譜準分子離子峰、碎片離子峰等信息，并結合相關文獻資料，2種干燥方式均共鑒定出62個化學成分，其中在天舒膠囊中首次被報道的化合物有21個，說明在化學成分種類上，2種干燥方式差異不大，僅部分峰的響應值有所區別。但與熱風循環干燥相比，噴霧干燥作為將系統化技術用于物料干燥的一種干燥方法，能提高生產效率、節約能耗，在實際生產應用中優勢明顯。本研究采用UPLCDAD結合UPLCQTOFMS/MS技術建立的質量評價體系，從定性與定量兩方面全面系統評價天舒膠囊的生產工藝，為生產過程中生產工藝的質量評價提供了新的思路。

[參考文獻]

[1]南京中醫學院 中醫方劑大辭典[M] 北京：人民衛生出版社，1993.

[2]劉丹，劉俊超，王星星，等. 不同干燥工藝對參蒲盆炎顆粒浸膏中芍藥苷、虎杖苷和延胡索乙素的影響[J]. 中草藥，2017，48 （3）：474.

[3]張艷軍，劉莉莉，胡軍華，等. BoxBehnken響應面法優化鼻鼽顆粒醇提浸膏噴霧干燥工藝研究[J]. 中國中藥雜志，2015，40 （18）：3585.

[4]Liang J J， Gao H M， Chen L M， et al. Chemical profiling of an Antimigraine Herbal preparation， Tianshu capsule， based on the combination of HPLC， LCDADMSn， and LCDADESIITTOF/MS analyses[J]. Evid Based Comp Alternat Med， 2014， 10：1155.

[5]Tang C L， Wang L， Li J J， et al. Analysis of the metabolic profile of parishin by ultraperformance liquid chromatography/quadrupoletime of flight mass spectrometry[J]. Bipmed Chromatogr， 2015， 29：1913.

[6]Ruan M， Li Y， Li X， et al. Qualitative and quantitative analysis of the major constituents in Chinese medicinal preparation GuanXinNing injection by HPLCDADESIMSn[J]. J Pharm Biomed Anal， 2012， 59：184.endprint

[7]Li W X， Tang Y P， Qian Y F， et al. Comparative analysis of main aromatic acids and phthalides in Angelicae Sinensis Radix， Chuanxiong Rhizoma， and FoShouSan by avalidated UHPLCTQFMS/MS[J]. J Pharm Biomed Anal， 2014， 99：45.

[8]Chen L L， Qi J， Chang Y X， et al. Identification and determination of the major constituents in traditional Chinese medicinal formula DangguiShaoyaoSan by HPLCDADESIMS/MS[J]. J Pharm Biomed Anal， 2009， 50：127.

[9]李慧慧 天麻地上部分化學成分研究及天麻藥材質量評價[D]. 合肥：安徽中醫藥大學，2015.

[10]陳思穎 基于多元指紋圖譜技術的天麻藥材質量控制研究[D]. 貴陽：貴陽醫學院，2014.

[11]倪書茂，錢大瑋，尚爾鑫，等. 大川芎方化學成分的超高效液相色譜電噴霧四極桿飛行時間質譜分析[J]. 中國實驗方劑學雜志，2010，16（1）：39.

[12]林曉，袁瑩，洪燕龍，等. 大川芎方中天麻效應組分的體內移行研究[J]. 中國中藥雜志，2011，36 （9）：1175.

[13]秦建平，孫曉萍，吳建雄，等. 天舒膠囊血中移行成分的UPLCQTOFMS分析[J]. 中草藥，2015，46（5）：649.

[14]胡楊 川芎化學成分分離提取及結構鑒定研究[D]. 沈陽：長春師范大學，2013.

[15]蔡皓，喬鳳仙，裴科，等. UHPLCQTOF MS和化學計量學方法分析川芎硫磺熏蒸前后化學成分的變化[J]. 質譜學報，2017，38（1）：127.

[16]李云，王志偉，耿巖玲，等. 基于 HPLCESITOF/MS法分析測定烏天麻和紅天麻中化學成分的研究[J]. 天然產物研究與開發，2016（28）：1758.

[17]范震宇 天舒膠囊效應部位組的探索性研究[D]. 南京：南京中醫藥大學，2011.

[18]曾志，謝潤乾，張濤，等. 川芎中內酯類化合物的質譜學規律[J]. 質譜學報，2011，32 （5）：293.

[19]Li Y J， Wang Z Z， Bi Y A， et al. The evaluation and implementation of direct analysis in real time quadrupole timeofflight tandem mass spectrometry for characterization and quantification of geniposide in Re Du Ning Injections[J]. Rapid Commun Mass Spectrom， 2012， 26：1377.

[責任編輯孔晶晶]endprint