植物水提液和拮抗菌對香蕉枯萎病及土壤微生物的影響

漆艷香，張 欣，彭 軍，謝藝賢

(中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所，海南 ?？?571101)

植物水提液和拮抗菌對香蕉枯萎病及土壤微生物的影響

漆艷香，張 欣，彭 軍，謝藝賢*

(中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所，海南 ?？?571101)

【目的】 探討2種菊科植物全株水提液和2株拮抗菌對香蕉枯萎病及土壤微生物的影響，為香蕉枯萎病的防治措施提供參考依據?！痉椒ā坎捎门柙栽囼灧y定了向日葵(Helianthusannuus)、油麥菜(Lactucasativavar.longifoliafLam.)根莖葉水提液及洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia, TY)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens, DF)對香蕉枯萎病的防效及土壤中香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.cubenserace4, Foc4)、普通真菌、細菌和放線菌的數量變化?！窘Y果】向日葵、油麥菜、TY和DF處理均能降低香蕉枯萎病病情指數、減輕植株的受害程度，有一定的防病效果，其中向日葵、油麥菜處理防病效果較好(分別為39.02 %和34.18 %)。與對照(CK)相比，4種處理均能顯著提高土壤中細菌數量，減少放線菌、Foc4和普通真菌數量，且均達顯著性水平。相關性分析發現，防病效果與土壤中Foc4及普通真菌呈顯著正相關，與細菌及放線菌則呈顯著負相關?！窘Y論】向日葵、油麥菜全株水提液及拮抗菌TY和DF均有利于改善土壤微生物結構，減輕和延緩香蕉枯萎病的發生為害，其中向日葵、油麥菜全株水提液對香蕉枯萎病的防控作用及土壤微生物的影響相對明顯。

向日葵；油麥菜；洋蔥伯克霍爾德氏菌；解淀粉芽孢桿菌；香蕉枯萎??；防病效果

【研究意義】由尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusariumoxysporumf. sp.cubense, Foc)引起的香蕉枯萎病是一種毀滅性的土傳病害，化學防治、農業防治均難以從根本上解決該病的危害，而且還存在防治成本高、環境污染嚴重、生態負面影響大等缺點，是我國傳統香蕉產區種植面積逐步萎縮的主因[1]。種植抗枯萎病香蕉品種被認為是解決這一關鍵問題的最有效的措施，但目前我國主栽香蕉品種均不抗病,一些新引進或自選的抗枯萎病香蕉新品種在產量和商品性方面與當家品種巴西蕉還有較大的差距，直接影響蕉農和銷費者的接受程度，造成抗病新品種的推廣應用工作較被動[2]?！厩叭搜芯窟M展】生物防治被認為是目前較安全的防治措施，符合耕地質量提升及有機食品發展要求[3-5]。研究發現，菊科植物含有大量抗菌物質，對病原菌具有較強的抑菌活性[6-9]。菊科植物向日葵(Helianthusannuus)及油麥菜(Lactucasativavar.longifoliafLam.)根莖葉、莖葉與根部水提液對香蕉枯萎病菌孢子和菌絲有較強的抑制作用[10]。本實驗室分離保存的洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia，TY)能降解幾丁質和鐮刀菌酸、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens，DF)能降解幾丁質，2個菌株對香蕉枯萎病菌均有較強的抑制作用，且在盆栽與田間初步試驗中也有較好防效[11]?！颈狙芯壳腥朦c】目前關于向日葵、油麥菜、幾丁質或鐮刀菌酸降解菌對土壤微生物的影響及其與防病之間的相關性研究尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過盆栽試驗，探討向日葵、油麥菜全株水提液和拮抗菌TY和DF對香蕉枯萎病的防病效果及土壤微生物的影響，以期為香蕉枯萎病的大田綜合防治措施提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試香蕉品種為巴西蕉(MusaAAA Cavendish cv. Brazil)，杯苗由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所熱帶果樹病害課題組提供。香蕉枯萎病菌4號生理小種(Fusariumoxysporumf. sp.cubenserace 4，Foc4)由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所熱帶果樹病害課題組提供。向日葵Helianthusannuus為TK929和油麥菜Lactucasativavar.longifoliafLam.為抗熱無斑油麥208，均采自海南省澄邁縣福山鎮紅光農場。洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia, TY)能降解幾丁質和鐮刀菌酸，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens, DF)能降解幾丁質，均由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所熱帶果樹病害課題組提供。健康磚紅壤采自中國熱帶農業科學院?？谠簠^，其主要理化性質為酸堿度(pH)4.4，有機質含量58.0 %，堿解氮(N)52.5 mg · kg-1，速效磷(P)3.3 mg · kg-1，速效鉀(K)47.0 mg · kg-1。

1.2 試驗方法

1.2.1 Foc4孢子懸浮液制備 取培養好的菌絲塊，分多點接種到PDA培養基平板上，置于28 ℃恒溫培養箱中約7 d，菌絲長滿全皿，將少許無菌水倒入培養皿中，用滅菌毛筆輕輕刷洗培養基表面，獲得Foc4孢子懸浮液，用滅菌水制成1×106個·mL-1的分生孢子懸浮液。

1.2.2 拮抗菌液制備 將拮抗菌TY和DF活化培養后，分別挑取單菌落接種于LB培養液中，28 ℃、150 r/min 搖床振蕩培養24 h，用無菌LB液稀釋配制成濃度約為1×106CFU · mL-1的菌體懸浮液。

1.2.3 植物水提液制備 采集向日葵及油麥菜新鮮根莖葉，分別用去離子沖洗干凈，瀝干表面水份并切碎，稱取100 g加入200 mL無菌水，常溫下攪拌機攪碎成勻漿，離心，取上清并經0.22 μm濾膜過濾，獲得質量濃度為500 mg · mL-1水提液。

1.2.4 試驗設計 盆栽試驗于溫室內進行，設6個處理：S1．接種Foc4，澆灌500 mg · mL-1油麥菜根莖葉水提液；S2．接種Foc4，澆灌500 mg · mL-1向日葵根莖葉水提液；S3．接種Foc4，澆灌1×106CFU · min-1拮抗菌液TY；S4．接種Foc4，澆灌1×106CFU · min-1拮抗菌液DF；S5．CK(接種Foc4，澆灌無菌水)。每個處理設3個重復，每個重復3盆，每盆種植1株香蕉苗。每個塑料盆(14 cm×15 cm)裝2 kg土，將3～4葉期巴西蕉種植于盆中，淋足定根水，置于自然光照條件下培養。保持盆內土壤濕潤，待香蕉苗有6～7片葉，高約10 cm左右時，采用傷根澆灌法接種，每盆接入Foc4孢子懸浮液100 mL(1×106個min-1)，2 d后再向各處理盆內澆灌200 mL相應濃度的處理液，對照以清水代替。

1.2.5 試驗管理與取樣 試驗期間，各處理盆栽管理措施一致。澆灌處理液后第1、2、4、6、8周取環根際土樣，共取5次。采樣深度約為10 cm，最后1次取樣的同時觀察蕉苗發病情況，記錄發病癥狀。

1.2.6 土壤微生物測定 采用稀釋平板計數法測定土壤中細菌、真菌、放細菌、香蕉枯萎病菌(Foc4)數量，細菌培養采用牛肉膏蛋白胨培養基，放線菌培養采用高氏1號培養基，真菌培養采用馬丁-孟加拉紅鏈霉素瓊脂培養基，Foc4培養采用韓寶坤等提出的培養基和方法[12]。

圖1 不同處理對香蕉枯萎病病情指數及防病效果的影響Fig.1 Effects of different treatments on banana fusarium wilt disease index and disease-control (8 weeks after treatment)

1.2.7 病情指數與防病效果 香蕉枯萎病病情統計方法參考文獻[13]的方法進行，并計算病情指數及病情抑制率。病情指數=[∑(病情級別×該病情級別的植株數)/ (病情最高級值×處理植株總數)]×100，防病效果=[(對照病情指數-處理病情指數)/ 對照病情指數]×100 %。

1.3 數據分析

所有數據均采用 Excel 2007 和 DPS數據處理系統處理，采用Duncan’s分析對數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 植物水提物及拮抗菌對香蕉枯萎病的防病效果

從圖1可以看出，處理8周后，S5處理(CK)的植株病情指數最高，S1～S4處理病情均顯著低于CK，說明澆灌植物根莖葉水提液及拮抗菌液對香蕉枯萎病有一定的防效。其中S1(油麥菜水提液)的病情指數最低，防效為38.02 %，其次為S2(向日葵水提液)，防效為34.18 %，S3～S4處理的病指較高，防效均較差。

2.2 植物全株水提物及拮抗菌對土壤微生物的影響

圖2 不同處理對土壤中香蕉枯萎病菌數量的影響Fig.2 Effects of different treatments on Foc4 population in the soil

2.2.1 香蕉枯萎病菌(Foc4)數量 由圖2可以看出，相對于CK，4個處理都不同程度地降低了土壤中Foc4數量，且與CK 的差異均達到顯著水平。在整個試驗期間，S1處理土壤中Foc4數量最低，處理8周后，僅為7.12×103CFU · g-1，其次是S2，為8.92×103CFU · g-1，二者間雖無顯著差異，但均顯著低于其它處理，各處理Foc4數量為S5>S4>S3>S2>S1。

此外，同一處理在不同處理時間內土壤中Foc4也有所不同，但變化趨勢相似。處理后1～4周，Foc4數量整體呈上升趨勢，以S5(CK)上升最為顯著，從243.00×103CFU · g-1增長到763.00×103CFU · g-1。S2處理從第1周時的8.82×103CFU · g-1增長到第4周時的15.95×103CFU · g-1，增長幅度僅為CK的66 %，增長最為緩慢。處理后4～8周，各處理Foc4數量整體表現為下降趨勢，其中4～6周下降顯著，6～8周期間趨于平緩。

2.2.2 可培養真菌數量 由圖3看出，在整個試驗期間，4個處理土壤中真菌數量均低于CK，不同處理與 CK 之間真菌數量的差異均達到顯著水平。整個試驗期間S1處理土壤中真菌數量最低，處理8周后，真菌數量為41.00×105CFU · g-1，其次是S2，真菌數量為47.90×105CFU · g-1，分別比CK減少了36.63 %和24.80 %，各處理真菌數量為S5>S4>S3>S2>S1。

圖3 不同處理對土壤中真菌數量的影響Fig.3 Effects of different treatments on fungus population in the soil

圖4 不同處理對土壤中細菌數量的比較Fig.4 Effects of different treatments on bacterium population in the soil

此外，處理后1～4周，真菌數量整體呈上升趨勢，4～6周時，各處理真菌數量整體表現為下降趨勢，6～8期間周趨于平緩，這與Foc4數量變化趨勢相似。

2.2.3 可培養細菌的數量 由圖4可以看出，在整個試驗期間，4個處理土壤中細菌數量都高于CK，且不同處理與 CK 之間細菌數量的差異均達到顯著水平。整個試驗期間S1處理土壤中細菌數量最高，并于第4周時達到最大值385.90×107CFU · g-1，顯著高于其它各處理。處理8周時，S1～S4處理可培養細菌數量分別是CK的53.10、48.50、47.70和25.10倍，各處理細菌數量為S1>S2>S3>S4>S5。

此外，處理后1～4周，細菌數量整體呈上升趨勢，4～8周期間，各處理細菌數量整體表現為下降趨勢，其中4～6周時下降較快，6～8周期間趨于平緩，這與Foc4及真菌數量變化趨勢相似。

2.2.4 可培養放線菌的數量 圖5表明，在整個試驗期間，各澆灌處理的放線菌數量均高于CK，且不同處理與 CK 之間放線菌數量的差異均達到顯著水平。其中，S1處理土壤中放菌數量均最高，第1周時達最大值118.00×105CFU · g-1，其次為S2處理，二者無顯著差異，但均顯著高于其它處理。處理8周后，S1和S2處理可培養放線菌數量分別是CK的2.10和2.05倍，各處理放線菌數量為S1>S2>S3>S4>S5。此外，處理后1～8周，土壤中放線菌數量整體呈下降趨勢，這與Foc4、真菌及細菌數量變化趨勢不一致。

圖5 不同處理對土壤中放線菌數量的影響Fig.5 Effects of different treatments on actinomycete population in the soil

2.3 土壤微生物特征與香蕉枯萎病病情指數的相關性分析

第8周時，進行了土壤微生物與病情指數的相關分析。從表1可以看出，病情指數與病原菌Foc4及真菌數量呈極顯著和顯著正相關，與土壤中細菌、放細菌數量呈極顯著負相關，說明土壤中Foc4和其它真菌數量是香蕉枯萎病發病程度的主要因素。

3 討 論

目前，關于菊科植物、幾丁質或鐮刀菌酸降解菌抑菌作用的研究報道較少[6-11, 14-15]，利用菊科植物、幾丁質或鐮刀菌酸降解菌對香蕉枯萎病菌的抑制作用防治香蕉枯萎病的研究報道則更少，且都集中于香蕉枯萎菌的抑制效果方面，均未涉及其對土壤微生物的影響及其與防病之間的相關性分析，因此，關于菊科植物、幾丁質或鐮刀菌酸降解菌對土壤微生物的影響及其與防病之間的相關性研究然仍是空白。本研究探討2種菊科植物水提液和2株幾丁質或鐮刀菌酸降解菌對香蕉枯萎病及土壤微生物的影響，以期為香蕉枯萎病的大田綜防措施的制訂提供參考。

表1 病情指數與土壤中微生物特征的相關性

注：**表示相關性達極顯著水平(P<0.01)；*表示相關性達顯著水平(P<0.05)。

Note: ** indicate an extreme significant level of correlation (P<0.01); * indicates a significant level of correlation (P<0.05).

向日葵、油麥菜根莖葉水提液及拮抗菌TY和DF對香蕉枯萎病的盆栽防病試驗表明，澆灌向日葵、油麥菜根莖葉水提液及拮抗菌TY和DF均可降低香蕉植株的病情指數，其中以向日葵根莖葉水提液處理(S1)和油麥菜根莖葉水提液處理(S2)的病情指數較低，防病效果較好，由此說明油麥菜和向日葵全株水提液抑菌作用比拮抗菌TY和DF強，而向日葵、油麥菜對香蕉枯萎病的后期防病效果有待進行大田試驗觀察。

植物對土傳病害的抗性與根際土壤微生物關系密切，土壤微生物數量和防病效果相關。向日葵、油麥菜根莖葉水提液及拮抗菌TY和DF均抑制了土壤中香蕉枯萎病菌和真菌數量的增長，說明向日葵、油麥菜根莖葉水提液及拮抗菌TY和DF還有可能抑制其他真菌性病原菌的繁殖，這就為防治其他作物的土傳真菌性病害提供了可能。相反，同樣處理土壤中細菌的數量呈增加趨勢，由此說明這施入土壤后在香蕉根系周圍形成了有益微生物優勢菌群，增加了土壤微生物數量。這與香蕉枯萎病危害程度輕的土壤中細菌數量明顯高于危害程度高的土壤的研究結論一致[16-17]。

盡管放線菌數量呈下降趨勢，但第8周時，向日葵、油麥菜處理土壤放線菌數量仍分別是對照的2.1和2倍，相關性分析也表明，香蕉病情指數與土壤中病原菌Foc4、普通真菌數量呈極顯著和顯著正相關，與細菌、放線菌呈極顯著負相關，土壤中病原菌Foc4及普通真菌數量的增加有利于病害的發生，細菌、放線菌數量的增加則有利于病害的降低，這一研究結果與丁文娟等[16]研究結論一致。因此，向日葵、油麥菜根莖葉水提液及拮抗菌TY和DF對香蕉枯萎病有防效，不僅源自于自身對病原菌的直接抑制作用，對土壤微生物的生態平衡也有改善作用，進而提高了土壤的抑病性，從而對香蕉枯萎病的擴展起到間接控制作用。

4 結 論

本研究結果表明，在香蕉生長期間澆灌向日葵、油麥菜根莖葉水提液及拮抗菌TY和DF均有利于改善土壤微生物結構，減輕和延緩香蕉枯萎病發生為害，其中向日葵、油麥菜根莖葉水提液對香蕉枯萎病的防控作用及土壤微生物的影響相對明顯。這一研究結果可為香蕉—間作或輪作向日葵(或油麥菜)防治香蕉枯萎病提供參考。

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EffectsofAqueousExtractsofSomePlantsandAntifungalStrainsonBananaFusariumWiltDiseaseandSoilMicroorganisms

QI Yan-xiang, ZHANG Xin, PENG Jun, XIE Yi-xian*

(Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Hainan Haikou 571101, China)

【Objective】The present experiment was conducted to investigate effects of two antifungal strains, whole plant aqueous extracts from two Asteraceae plants on banana fusarium wilt disease and soil microorganisms, in order to provide references for the control of banana fusarium wilt disease. 【Method】 Based on the pot trial, effects of two antifungal strainsBurkholderiacepacia(TY) andBacillusamyloliquefaciens(DF), whole plant aqueous extracts fromHelianthusannuusandLactucasativavar.longifoliafLam. on banana fusarium wilt disease,Fusariumoxysporumf. sp.cubenserace4 (Foc4), common fungus, bacterium and actinomyce population were determined and analysed. 【Result】 Banana disease severity and disease index of different treatments were reduced to some extent by applying antifungal strains TY and DF, whole plant aqueous extracts fromH.annuusandL.sativavar.longifoliaf. Furthermore,H.annuusandL.sativavar.longifoliafhad the better effect on control of banana fusairum wilt disease in pot, with the 39.02 % and 34.18 % efficacy, respectively. Compared to the control (CK), four treatments could remarkable increase the number of bacteria, reduce the number of actinomycetes, Foc4 and common fungi in soil. Based on the correlation analysis, the disease-control effect was significantly positively correlated with the number of both Foc4 and normal fungi in soil, but significantly negatively with the number of bacteria and actinomycetes in soil.【Conclusion】Application of antifungal strains TY and DF, whole plant aqueous extracts fromH.annuusandL.sativavar.longifoliafat banana vegetable period could improve soil microorganism structure, reduce or delay banana fusarium wilt disease occurrence, among which effects of whole plant aqueous extracts fromH.annuusandL.sativavar.longifoliafon banana fusarium wilt disease and soil microorganisms are greater than those of antifungal strains TY and DF.

Helianthusannuus；Lactucasativavar.longifoliafLam.；Burkholderiacepacia；Bacillusamyloliquefaciens；Banana fusarium wilt disease；Control effect

1001-4829(2017)5-1092-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.5.019

2016-06-17

現代農業產業技術體系建設專項資金(CARS-32-04)；海南耕地改良關鍵技術研究與示范專項課題(HNGDpz2015)；國家自然科學基金項目(31471738)；農業部南亞辦專項(16RZBC-16)

漆艷香(1975-)，博士，副研究員，主要從事熱帶果樹病害的診斷、病原學及防治，E-mail: qiyanxiang@ catas.cn，*為通訊作者，謝藝賢(1962-)，研究員，主要從事熱帶果樹病害鑒定與防控技術研究。

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(責任編輯 李山云)