鱘源病原菌HD0824的分離鑒定及藥敏特性研究

楊移斌，劉 洋，夏永濤，楊先樂，艾曉輝*

(1.中國水產科學研究院長江水產研究所, 湖北 武漢 430223; 2.江西省奉新縣畜牧水產局, 江西 奉新 330700; 3.中國水產科學研究院北京院部, 北京 100039; 4.上海海洋大學 國家水生動物病原庫, 上海 201306)

鱘源病原菌HD0824的分離鑒定及藥敏特性研究

楊移斌1，劉 洋2，夏永濤3，楊先樂4，艾曉輝1*

(1.中國水產科學研究院長江水產研究所, 湖北 武漢 430223; 2.江西省奉新縣畜牧水產局, 江西 奉新 330700; 3.中國水產科學研究院北京院部, 北京 100039; 4.上海海洋大學 國家水生動物病原庫, 上海 201306)

【目的】對患病西伯利亞鱘進行病原分離、鑒定及藥敏實驗，為鱘嗜水氣單胞菌病的防控提供參考?！痉椒ā繌幕疾〉奈鞑麃嗺\(Acipenserbaerii)的體內分離到一株致病菌株HD0824，該菌株具有高致病性，能使小白鼠24 h 內死亡。經過人工感染，感染用魚出現與自然發病相同的癥狀，表明菌株HD0824為鱘魚此病病原?！窘Y果】菌株HD0824為革蘭氏陰性桿，無芽孢和莢膜，在兔血平板上能形成明顯的β-溶血，蛋白酶活性很強。經過生理生化鑒定及16S rDNA序列分析，菌株HD0824為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，同源性達99 %。此外，分離菌株HD0824對慶大霉素、強力霉素、氯霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、頭孢噻肟、阿奇霉素及左氧氟沙星8種藥物高度敏感，對新霉素中度敏感?！窘Y論】分離菌株HD0824是西伯利亞鱘病原菌，養殖時可選用慶大霉素及氟苯尼考等藥物進行防控。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)；西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)；鑒定；藥敏特性

【研究意義】鱘魚隸屬于鱘形目(Acipenseriformes)全身大部分是軟骨，常被稱為軟骨硬鱗魚類。鱘魚是大型經濟魚類，因其肉質鮮美、骨脆營養豐富、具有較高的食用經濟價值，特別是用其卵加工而成的魚子醬富含高蛋白、微量元素和多種維生素，更是馳名中外的高檔食品，素有“黑色黃金”之稱?！厩叭搜芯窟M展】目前中國鱘魚養殖種類主要有西伯利亞鱘、史氏鱘等，西伯利亞鱘因具有生長速度快、適應能力強、成活率高、抗病力強、食用營養豐富、魚籽醬品質好等特點，使其成為鱘魚養殖產量最大的品種[1]。然而隨著人工養殖規模不斷擴大，養殖節約化程度不斷提高。鱘魚養殖受到各種疾病困擾[2-8]，病害已經成為鱘魚健康養殖的一大阻力，因此對于鱘魚養殖中遇到的疾病進行病原分離鑒定及藥敏試驗顯得尤為重要。2011年9月初在浙江省衢州市鱘魚養殖場發現西伯利亞鱘出現以肛門紅腫潰爛，肝臟充血出血，體壁充血，脾臟充血發黑，性腺潰爛甚至掉出體外，性腺上分布有出血點，有大量血水流從生殖孔流出為主要癥狀的急性敗血癥，死亡率高達80 %，死亡個體大多在20 kg左右，最大個體達50 kg，損失極為嚴重?！颈狙芯壳腥朦c】本研究從發病的西伯利亞鱘體內分離到一株細菌HD0824，動物攻毒試驗表明此細菌具有很強的致病力，經常規生理生化鑒定，16S rDNA基因系列測定和系統發育分析的方法對該細菌進行了分類鑒定，并進一步研究其藥敏特性?！緮M解決的關鍵問題】以期豐富鱘魚疾病病原的生物學特性，為鱘魚疾病科學有效防控提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 病魚收集 自然患病鱘魚來源于浙江省衢州鱘魚養殖基地，取自然發病癥狀典型的鱘魚為備用材料。

1.1.2 主要儀器 恒溫培養箱，冰箱，高壓蒸汽滅菌鍋，搖床，PCR儀，核酸電泳儀，顯微鏡，無菌操作臺，恒溫水浴鍋，電子爐。

1.1.3 主要試劑 普通營養瓊脂、腦心浸出液、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、兔血營養瓊脂、10 g/L脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂培養基、水解酪蛋白瓊脂(MH)按常規方法自配；細菌生化微量鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴增細菌16S rDNA試劑盒，TaqDNA聚合酶均購自上海生工生物工程技術服務有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；革蘭染料購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.4 試驗動物 健康西伯利亞鱘，由浙江省衢州市鱘魚養殖基地提供；6周齡雌性12只小白鼠購自上海實驗動物中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 流行病學調查 調查養殖場鱘魚發病率及死亡率，了解發病鱘魚種類及規格大小，掌握養殖水域環境狀況。查看鱘魚發病各個時期癥狀及解剖觀察，確定鱘魚此疾病的基本癥狀，取發病癥狀典型的病魚備用。

1.2.2 病毒排除試驗 取病魚潰爛明顯的性腺作為病毒排除試驗材料，將其剪碎，其后在研缽中加玻璃珠繼續研磨，加等量生理鹽水，5000轉離心10 min，取上清液，加入每1 mL上清液中加入10 000單位的抗生素，包括青霉素和慶大霉素，經5次凍融后使用。感染用鱘魚10尾平均分成2組，試驗組每尾西伯利亞鱘注射上清液0.2 mL，對照組每尾注射等量生理鹽水。試驗期間正常投喂，連續充氧，保持水溫26 ℃，水質良好，溶氧正常。定期觀察鱘魚動態，記錄發病及死亡情況。結果試驗組西伯利亞鱘未出現自然發病癥狀，更未出現死亡，故排除病原為病毒的可能性。

1.2.3 病原菌分離純化 選具有典型自然發病癥狀瀕死的西伯利亞鱘，用75 %的酒精反復擦拭病魚體表后，在無菌條件下，取性腺、肝臟等病灶部位少許以及少量血水，分別于胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養基和普通營養瓊脂平板上劃線分離，置于28 ℃培養箱中恒溫培養24 h，挑起形態一致，優勢度大的單一菌落進一步劃線純化，并接種于TSA培養基斜面于4 ℃冰箱保存。

1.2.4 動物攻毒試驗 分離純化后的菌株HD0824接種于營養瓊脂上28 ℃培養24 min，用無菌生理鹽水洗下菌苔，用麥氏比濁法測定并調節菌懸液濃度為4×107CFU/mL。

人工感染：選取健康的西伯利亞鱘，設1個試驗組和1個對照組。試驗組為6尾，對照組為4尾，每組設置2個重復。試驗組胸鰭基部注射菌懸液0.2 mL，對照組胸鰭基部注射等量無菌生理鹽水。試驗期間正常投喂，連續充氧，保持水溫20～22 ℃，水質良好，溶氧正常。定期觀察鱘魚動態，記錄發病及死亡情況，并對瀕死鱘魚及時進行解剖和病原分離。

毒力檢測試驗：選取健康小白鼠12只，平均分成A、B、C 3 組，A組注射菌懸液0.1 mL，B組注射菌懸液0.2 mL，C 組注射0.2 mL無菌生理鹽水，均采取腹腔注射。觀察24 h 內小白鼠死亡情況。

1.2.5 病原菌形態學觀察及理化特性檢測 將分離菌株HD0824接種于普通營養瓊脂平板、TSA平板、兔血營養瓊脂平板和10 g/L脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂培養基平板，28 ℃培養24 h后觀察菌落的大小、形態、溶血狀況及蛋白酶活性，同時進行革蘭氏染色，用光學顯微鏡進行細菌形態學觀察，其他各項生理生化指標的測定參照有關文獻進行[9]。

1.2.6 分離菌株HD0824的16S rDNA基因序列測定與分析 (1)PCR模板的制備：將細菌HD0824接種于腦心浸出液培養基(BHI)中，28 ℃搖菌18 h后12 000 r/min離心收集菌體，按細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌總DNA，作為PCR的模板DNA。

(2)16S rDNA基因系列的擴增與測序：用于16S rDNA的PCR反應的引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

正向引物為27F：5’-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3’(對應于E.coli的16S rRNA基因的第8～27 bp位置)；反向引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(對應于E.coli的16S rRNA基因的第1492～1510 bp位置)；PCR反應條件為：95 ℃變性3 min，94 ℃平衡35 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，此階段35個循環，72 ℃溫育10 min。經PCR擴增后的產物進行1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測以證明PCR 擴增得到的片段是否是目的片段后，將PCR的最終產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行純化和序列測定。

(3)構建系統發育樹：將菌株HD0824的16S rDNA序列用運用NCBI數據庫中細菌的16S rDNA進行比對，分離菌株HD0824從中選取數株與該株菌基因序列最相似的菌株和幾種水產常見病原菌，采用Clustal w軟件進行多序列匹配分析，用MEGA5.1軟件包中的Neighbor-Joining法構建系統進化樹，通過1000 次 Bootstrap檢驗置信度。

1.2.7 藥敏試驗 藥敏試驗采用標準的K-B法，將菌株HD0824接種于腦心浸出液(BHI)培養基，置于28 ℃搖床培養18 h 后涂布于水解酪蛋白瓊脂(MH)平板。選擇 17 種藥敏紙片均勻貼于平板，每個平板貼 5 片，置28 ℃下培養24 h 后測量抑菌圈直徑(mm)。根據《現代診斷學手冊》[10]標準判定菌株對藥物的敏感性特性。

2 結果與分析

2.1 自然發病流行情況調查及臨床診斷

2011年9月初浙江省衢州市鱘魚養殖基地鱘魚出現鱘魚死亡，發病后死亡率高達80 %，發病水溫在20 ℃及以上，發病個體在5～30 kg。發病初期病魚精神不振，或靜止不動，或狂游不止，有時也貼緊池壁游動，嚴重者身體失去平衡形成腹部露出水面的現象，幾乎不進食。出現癥狀多數一周內死亡，病魚受到刺激后可能數小時內死亡。發病鱘魚主要集中在西伯利亞鱘，癥狀表現為鱘魚肛門一側出現細線紅腫，有開始潰爛癥狀，解剖后看到肝臟充血腫大而且出血，脾臟嚴重充血發黑，腎臟充血，腹腔有大量出血導致倒提鱘魚從生殖孔流出體外，體壁嚴重充血，也有體壁未充血的，性腺有大量出血點，產生潰爛，更嚴重的是生殖孔與腹腔相連的膈膜爛穿，肛門一側潰爛開口，性腺掉出，直至鱘魚死亡。此病流行于水溫在20 ℃及以上，水溫低于20 ℃亦可能發病，但較少。發病鱘魚集中在西伯利亞鱘，其余鱘魚發病較少，雌雄鱘魚都可能發病。發病鱘魚個體目前發現最小3齡，據調查其他養殖基地也有類似疾病。

2.2 病原菌分離純化

從具有典型發病癥狀瀕死的病魚取性腺、肝臟等病灶部位少許以及少量血水劃線于普通營養瓊脂平板和TSA平板上，置于28 ℃恒溫培養箱培養24 h 后經純化獲得一株優勢細菌，編號HD0824。該菌在營養瓊脂平板和TSA平板上生長良好，形成圓形，表面光滑，邊緣整齊,中央菌落呈凸起狀，直徑0.9～1.1 mm的透明的菌落。

2.3 動物攻毒試驗

2.3.1 人工感染 試驗組注射菌懸液12 h后，試驗用魚出現精神不振，或靜止不動，或狂游不止，肛門出現紅腫潰爛，14 h 后出現死亡，24 h 試驗組全部死亡，而對照組無任何異常。解剖后看到肝臟充血腫大而且出血，脾臟嚴重充血發黑，腎臟充血，腹腔有大量出血導致倒提鱘魚從生殖孔流出體外，體壁嚴重充血，性腺有大量出血點，產生輕微潰爛，性腺未因肛門爛開而掉出體外，與自然發病鱘魚癥狀基本一致。并從感染死亡鱘魚肝臟、性腺及血水中分離到與菌株HD0824形態、生理生化特性和16S rDNA基因序列分析一致的細菌，表明菌株HD0824是西伯利亞鱘此病病原菌。

2.3.2 毒力檢測試驗 試驗組小白鼠在24 h 內死亡率達100 %，注射劑量為0.2 mL的試驗組先出現死亡，解剖后發現小白鼠肝臟嚴重出血并且壞死，腸道也出現出血現象。

2.4 病原菌形態學觀察

分離菌株HD0824為革蘭氏陰性短桿菌，沒有芽胞和莢膜。在TSA平板上菌落呈圓形，表面光滑，邊緣整齊，中央菌落呈凸起狀，直徑0.9～1.1 mm的透明的黃色菌落。在普通營養瓊脂平板上菌落呈淡黃色，圓形，表面光滑，中央菌落呈凸起狀，直徑0.6～0.9 mm的透明的菌落。

2.5 病原菌理化特性檢測

分離菌株HD0824為具有運動能力的G-桿菌，在兔血營養瓊脂平板能產生β-溶血，蛋白酶活性檢測呈陽性，其它的生理生化特征見表1。

2.6 分離菌株HD0824的16S rDNA基因PCR擴增結果及系統發育分析

PCR擴增分離株HD0824獲得的16S rDNA基因片段約1500 bp。測序結果得出此系列1420 bp，把測序結果與NCBI中已收錄的相關性較高的16S rDNA序列進行比對分析表明，從發病西伯利亞鱘體內分離的細菌16S rDNA基因序列與嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)同源性最高，均為99 %，選取了檢索的部分16S rDNA用Neighbor-Joining方法進行系統發育學分析，其系統發育樹如圖1所示。在系統發育樹上菌株HD0824與嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)聚為一個分支。根據分離菌的形態特征及理化特性，結合16S rDNA序列測定與系統發育分析結果，判定該菌為嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)。

表1 HD0824菌株的生理生化特征

注:“+”表示陽性，“-”表示陰性,“(+)”表示陽性反應超過24h,“(-)”表示陰性反應超過24h,“d”表示11 %～89 %菌株為陽性。

Note:‘+’ means positive; ‘-’ means negative; ‘(+)’ The time of positive reaction exceed 24 h; ‘(-)’ The time of negative reaction exceed 24h; ‘d’ means 11 %-89 % strain is positive.

2.7 藥敏試驗結果

從表2可以看出，分離菌株HD0824對慶大霉素、強力霉素、氯霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、頭孢噻肟、阿奇霉素及左氧氟沙星8種藥物高度敏感，對新霉素中度敏感。

3 討 論

本研究從發病西伯利亞鱘肝臟、性腺及少量血水中均分離到一株優勢度達99 %病原菌HD0824，為革蘭氏陰性短狀桿菌。通過動物攻毒試驗，發現其屬高致病性病原菌，人工感染西伯利亞鱘后產生肛門出現紅腫潰爛，肝臟充血腫大而且出血，脾臟嚴重充血發黑，腎臟充血，腹腔有大量出血導致倒提鱘魚從生殖孔流出體外，體壁嚴重充血，性腺有大量出血點，產生輕微潰爛與自然發病鱘魚癥狀一致，表明此細菌為鱘魚此病的病原菌之一。根據細菌的形態學特征和生理生化特性初步確定為嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)，但由于其在利用D-甘露糖等與嗜水氣單胞菌標準菌株存在一定差異(表1)，故而不能進行準確的鑒定，這也是細菌生化鑒定的弱點所在，每個反應的程度受到各方面的影響，很難統一，故需尋找一種更為準確的方法加以鑒定，和生化鑒定結合達到準確分類鑒定細菌的目的。目前隨著科學技術的快速發展，特別是分子生物領域取得突破性進展，細菌的鑒定也進入到分子生物學時代，多種基因型分類方法也應運而生，如DNA雜交、rDNA指紋圖、質粒圖譜、(G+ C)mol %、16S rDNA序列分析及Gyrb序列分析等。目前，由于16S rDNA 序列分析已廣泛應用于水產動物病原菌的鑒定[11-12]。本研究基于HD0824菌株的16S rDNA基因序列構建了系統發育樹，結果表明該菌與嗜水氣單胞菌同源性達到了99 %，同時結合形態學和理化特征鑒定該菌為嗜水氣單胞菌。本次西伯利亞鱘發病水溫在20 ℃左右，出現的癥狀與報道的敗血癥有一定的相似之處，但是不同的是本次發病鱘魚出現了性腺嚴重潰爛，甚至掉出體外，值得關注，潰爛的原因可能是嗜水氣單胞菌被解體后釋放毒素造成的，這提示治療包括嗜水氣單胞菌在內的革蘭氏陰性菌引起的疾病應注意使用抗菌藥后，需對體內細菌釋放的內毒素加以清除，才能達到更好的治療效果。

嗜水氣單胞菌是在自然界中廣泛存在的[13]，是一種典型的人-畜-魚共患病病原菌。嗜水氣單胞菌(A.hydrophica)，屬弧菌科(Virbhonaceae)，氣單胞菌屬(Aeromonas)，為革蘭陰性短桿菌，極端單鞭毛，無芽孢和莢膜，散在排列。對環境要求不高，普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人類糞便中，專性需氧，生長溫度5～40 ℃，最適溫度28 ℃，pH 6～11，最適為pH 7，分為致病性和非致病性菌株[14]。致病性菌株可感染魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類等動物，主要癥狀為急性出血性敗血癥，慢性感染癥狀一般為皮膚潰爛。該菌可引起淡水魚細菌性敗血癥，蛙類的紅腿病，中華鱉的紅脖子病、紅底斑病、穿孔病、腐皮病等[14-15]。尤其是每年的7-9月份，由于氣溫較高，應激較大，往往造成該病爆發[14]。自20世紀90年代以來，該病原菌常引起我國淡水養殖魚類的暴發性敗血癥，給水產養殖業造成了極大的經濟損失[2-5]。本次研究中從發病西伯利亞鱘體內分離到的嗜水氣單胞菌使鱘魚性腺潰爛掉出體外尚屬第一次報到，其具有較高的溶血素及蛋白酶活性，毒力很強。隨著養殖規模的擴大，養殖水域環境日益惡化，及鱘魚產品貿易來往，為嗜水氣單胞菌的傳播提供了途徑和場所，使得其危害不斷增大，流行區域大增。因此在鱘魚養殖過程中要重視嗜水氣單胞菌的感染，對其感染產生的新癥狀加以分析，及時找到防治方法減少養殖生產損失。

圖1 根據16S rDNA基因序列同源性構建的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence homolog

藥物Drug抑菌直徑判斷標準(mm)Judgmentstandardofinhibitionzonediameter耐藥Resistant中度敏感Mediumsensitivity高度敏感Highlysensitive藥物含量(μg·disc-1)Dose抑菌直徑(mm)Inhibitionzonediameter敏感性Sensitivity強力霉素≤1213～15≥163022S丁胺卡那霉≤1415～16≥173023S氟苯尼考≤1213～17≥187528S鏈霉素≤1112～14≥151014R氯霉素≤1213～17≥183020S頭孢噻肟≤1415～22≥233025S先鋒霉素V≤1415～17≥183014R青霉素≤1920～27≥2810U0R紅霉素≤1314～22≥231512R克林霉素≤1415～20≥2120R阿莫西林≤1314～17≥18100R阿奇霉素≤1314～17≥181525S利福平≤1617～19≥20515R左氧氟沙星≤1314～16≥17530S痢特靈≤1415～16≥1730013R慶大霉素≤1213～14≥151023S新霉素≤1213～16≥173014I

注：S表示高度敏感，I表示中度敏感，R表示耐藥。

Note：S is highly sensitive, I is medium sensitivity, and R is resistant.

分離菌株HD0824對慶大霉素、強力霉素、氯霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、頭孢噻肟、阿奇霉素及左氧氟沙星8種藥物高度敏感，對新霉素中度敏感，與孟彥等分離到的嗜水氣單胞菌的藥敏特性不同[3]，也與李圓圓等[4]和褚衛華等[16]分離到的嗜水氣單胞菌的藥敏特性不同[4]，產生這些藥敏特性差異的原因可能是不同地區嗜水氣單胞菌所處環境，水域條件，氣候狀況，及接觸的藥物不同導致耐藥性不同[17]。在生產上可以選用本研究中高敏藥物進行防治，但是由于是理論研究，故不是所有的藥物都可以用于生產，更多是研究此病原菌的藥敏特性，如氯霉素就可以用氟苯尼考替代用于養殖生產疾病防治。從藥敏試驗結果來看，化學藥物是疾病防治的有效手段，但是由于長期使用，病原菌對常用抗生素已經產生了極強的耐藥性，這樣必能導致疾病防治失敗，這就警示我們在養殖生產中需慎重考慮使用抗生素，盡可能尋找生物防治等辦法控制疾病發生，避免造成更大損失。

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IsolationandIdentificationPathogenicBacteriaHD0824fromAcipenserbaeriiandItsAntibioticSensitivity

YANG Yi-bin1，LIU Yang2，XIA Yong-tao3，YANG Xian-le4，AI Xiao-hui1*

(1.Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Hubei Wuhan 430223, China; 2.Animal Husbandry and Aquatic Products Bureau of Fengxin County, Jiangxi Fengxin 330700, China; 3.Chinese Academy of Fishery Sciences, Beijing 100039, China; 4.State Collection Center of Aquatic Pathogen, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

【Objective】The study was aimed at the isolation, identification and antibiotic sensitivity of pathogen from sickedAcipenserbaerii, which would provide a reference for control and prevention disease forAcipenserbaerii.【Method】The pathogenic bacterial strain HD0824 from Siberian sturgeon(Acipenserbaerii) suffering diseases was isolated, which could make laboratory rat die within 24 hours. The typical diseased symptoms as naturally occurred were experimentally reproduced after artificial infection, indicating the strains HD0824 was the pathogen of this diseases of sturgeon. 【Result】Strain HD0824 was gram negative, no spore and capsule, which had β-hemolytic activity on rabbit blood agar and had strong protease activity. By means of physiological and biochemical identification and 16S rDNA sequence analysis, strain HD0824 was identified asAeromonashydrophilawith 99 % homology. In addition, strain HD0824 was highly sensitive to gentamicin, doxycycline, chloramphenicol, amikacin, florfenicol, cefotaxime, azithromycin and levofloxacin and intermediately sensitive to one kind of antibiotics including neomycina. 【Conclusion】The isolated strain HD0824 was the pathogenic bacteria ofAcipenserbaerii, which could be prevented by administering drugs such as gentamicin and florfenicol in fisheries farming.

Aeromonashydrophila;Acipenserbaerii; Identification; Antibiotic sensitivity

1001-4829(2017)5-1239-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.5.044

2016-05-20

公益性行業(農業)科研專項(201203085)

楊移斌(1988-)，男，助理研究員，主要從事水生動物病害臨床診斷及其防控技術研究，E-mail:yangyb19888@126.com；*為通訊作者：艾曉輝(1968-)，男，研究員，研究方向：水產動物藥理學，E-mail:aixh@ yfi.ac.cn。

S941

A

(責任編輯 陳 虹)