寶藿苷I減輕急性神經炎癥所致的大鼠海馬神經元損傷

鄧媛媛，高 虎，石琬嵐，李 菲

(遵義醫學院 基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室，貴州 遵義 563099)

寶藿苷I減輕急性神經炎癥所致的大鼠海馬神經元損傷

鄧媛媛，高 虎，石琬嵐，李 菲

(遵義醫學院 基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室，貴州 遵義 563099)

目的考察寶藿苷I(BHG I)對脂多糖(LPS)誘導的大鼠急性神經炎癥的作用及機制。方法雄性SD大鼠隨機分為假手術對照組、模型組、BHG I給藥組。給藥組灌胃給予BHG 130 mg/(kg·d)，其余兩組灌胃給予等體積的生理鹽水。預防性給藥5天后，模型組及給藥組左側腦室注射5 μL脂多糖(1 μg/μL)制備急性神經炎癥大鼠模型，假手術對照組同法注射等體積生理鹽水。造模后24h取材，HE染色觀察大鼠海馬CA1區神經元結構及形態，透射電鏡觀察大鼠海馬CA1區神經元超微結構，Real time RT-PCR測定大鼠海馬組織中的環氧合酶-2(COX-2)、白細胞介素-1β(IL-1β)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA表達水平，Western blot實驗檢測炎癥相關蛋白腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-1β的表達。結果BHG I預防性給藥可減輕側腦室注射LPS引起的神經元排列紊亂、CA1區嗜酸性神經元變性、核固縮以及神經元的超微結構損傷；降低炎癥因子COX-2、IL-1β、iNOS的mRNA 及TNF-β、IL-1β的蛋白過度表達。結論預防性給予BHG I能拮抗LPS誘導急性神經炎癥從而減少神經元損傷，其機制與抑制海馬組織中炎癥因子的mRNA和蛋白過度表達有關。

寶藿苷I；脂多糖；炎癥；大鼠

中樞神經系統炎癥是神經退行性變的關鍵因素之一。在諸如帕金森氏病、阿爾茨海默病、多發硬化癥、血管性癡呆等多種中樞神經退行性疾病中均已證實神經炎癥扮演了關鍵角色[1-3]。神經炎癥發生過程中，小膠質細胞和星形膠質細胞被大量激活，釋放炎癥介質，從而產生細胞毒性反應，引起自由基形成、氧化應激反應及神經元損傷，最終導致神經元退行性變、凋亡及最終死亡[4]。

寶藿苷I(Baohuoside I,BHG I)，又名淫羊藿次苷Ⅱ(icariside Ⅱ)，是中藥淫羊藿(EpimediumbrevicornumMaxim)的有效成分之一，分子式C27H30O10，相對分子質量為514.53。BHG I藥理作用廣泛，包括抗神經元損傷、抗腫瘤、抗骨質疏松、改善心血管功能、提高性功能等[5-7]。此外，藥動學研究發現，BHG I是淫羊藿另一有效成分淫羊藿苷在腦內的主要代謝產物[8-10]。本課題組在前期研究中發現淫羊藿苷對多種中樞神經系統疾病具有積極作用，可對抗長期染鋁或海馬內注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)所誘導的大鼠癡呆，以及對自然衰老性癡呆模型的保護作用等[11-12]。然而，BHG I是否通過改善神經炎癥而緩解中樞退行性疾病，尚不清楚。因此，本研究擬通過大鼠側腦室注射LPS誘導急性神經炎癥模型，考察BHG I預防性給藥是否對急性神經炎癥有拮抗作用，并探索其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠60只，體重250～350 g，由重慶第三軍醫大學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK(渝)2013-0005。適應性飼養7 d。

1.1.2 主要藥品和試劑 BHG I(經HPLC檢測，純度gt;98%)購自南京澤郎醫藥有限公司；脂多糖購自美國Sigma公司；逆轉錄試劑購自寶生物工程有限公司；COX-2、IL-1β、iNOS及GADPH基因的引物序列從GenBank查詢并由上海生工生物工程有限公司合成，相關基因的引物序列(見表1)。

表1各基因的引物序列

基因基因庫入口上游引物下游引物COX-2NM_017232.3AACACGGACTTGCTCACTTTGTTGAATGGAGGCCTTTGCCACTGIL-1βNM_031512.2GCTGTGGCAGCTACCTATGTCTTGAGGTCGTCATCATCCCACGAGINOSNM_012611.3CTCACTGTGGCTGTGGTCACCTAGGGTCTTCGGGCTTCAGGTTAGAPDHNM_017008CAGTGCCAGCCTCGTCTCATAACCAGGCGTCCGATACG

1.1.3 主要儀器 RNA逆轉錄儀(Eppend of Mastercycler Gradient PCR)購于德國Eppendorf公司；PCR熱循環儀(iCycler iQ)購置于美國Bio-Rad公司；電子分析天平(BS-110S)購置于北京賽多利斯天平有限公司；大鼠腦立體定位儀(SR-6N)購置于日本東京Setagaya.ku公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及給藥 隨機法分為3組，分別為假手術對照組(sham，n=20)，模型組(LPS，n=20)，治療組(LPS+BHG I，n=20)。分組后次日開始給藥，治療組灌胃BHG I 30 mg/kg/d，假手術組和模型組灌胃等體積的生理鹽水(normal saline,NS)。

1.2.2 造模 預防性給藥5 d后進行手術造模。大鼠經7%水合氯醛麻醉后，固定在腦立體定位儀上，剪毛、消毒，沿頭部正中切口(1.0 cm)，暴露前囟及正中線。側腦室進針坐標為：AP-0.8 mm(前囟后)、ML-1.5 mm(中線左側)、H-3.8 mm(腦膜下深度)。定位后鉆開顱骨，微量注射器垂直進針，模型組、治療組注射5 μl濃度為1 μg/μL的LPS溶液。假手術組同法注射等體積NS。術后傷口外用紅霉素軟膏涂抹預防感染。

1.2.3 海馬組織形態學觀察 每組隨機取5只大鼠，經7%水合氯醛麻醉后，仰臥固定，4%多聚甲醛(PBS稀釋)透灌，斷頭取腦，固定后常規石蠟包埋，冠狀切片為厚度5 μm 腦片，參考課題組既往報導行HE染色法染色[13]。每組另取5只大鼠用于透射電鏡觀察，同前法透灌后斷頭取腦，分離海馬，用刀片將其切成勻稱的小塊后轉移至預冷的戊二醛電鏡固定液中。固定，丙酮梯度脫水，包埋，超薄切片(50～70 nm)；醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色后用透射電鏡觀察神經元超微結構。

1.2.4 Real time RT-PCR檢測COX-2、IL-1β和iNOS的mRNA表達 各組剩余大鼠麻醉后，斷頭取腦并快速分離海馬，將左側海馬組織置于盛有總RNA抽提試劑(Trizol)的EP管中，提取海馬總RNA，測定濃度。逆轉錄體系為10 μL，依次為5×Primescript buffer 2 μL、Prime RT Enzyme Mix 0.5 μL、Oligod T Primre 0.5 μL、Random 6 mers 0.5 μL、Total RNA 0.5 μg/CRNA、DEPC 水 6.5 - 0.5 μg / CRNA。經RNA逆轉錄儀逆轉錄后獲得cDNA，按10 μL RT-PCR 體系配置后進行擴增，SYBR green 5 μL、上下游引物 0.5 μL、DEPC 水 2.5 μL、cDNA 2 μL。反應步驟為第一步：95 ℃×8.5 min， 第二步：95 ℃ ×15 s，58 ℃×1 min，循環45 次。目的基因表達水平的相對定量法同課題組既往報導[14]，即① Ct average=(Ct1+Ct2)/2 (復孔)；②dCt值=Ct average-中間值；③目的基因的表達=2-dCt；④相對基因的表達=目的基因的表達/內參基因的表達(對照設為100)。

1.2.5 Western blot實驗 提取右側海馬總蛋白并計算蛋白濃度。將樣品制備后上樣至8% SDS-PAGE 凝膠梳孔，電泳，轉膜，封閉，一抗、二抗孵育后，ECL發光顯影，凝膠成像系統和Quantity One定量分析系統對結果進行半定量分析。

2 結果

2.1 BHG I對大鼠海馬組織CA1區神經元形態的影響 HE染色觀察大鼠海馬組織CA1區神經元形態，結果顯示，假手術組大鼠海馬CA1區神經元形態正常、排列整齊；模型組大鼠海馬CA1區細胞排列紊亂，神經元嗜酸性變性，核固縮。與模型組比較，BHG I預防性給藥組海馬CA1區神經元排列較為規整，僅見少量變性(見圖1)。

A、D:假手術組；B、E:模型組；C、F:BHG I治療組。圖1 HE染色觀察BHG I對大鼠海馬組織CA1區神經元形態的影響

2.2 BHG I對炎癥相關基因mRNA表達水平的影響 Real time RT-PCR檢測炎癥相關基因IL-1β、COX-2、iNOS的表達。結果發現，與假手術組比較，模型組大鼠海馬的IL-1β、COX-2、iNOS的mRNA表達水平明顯增高(Plt;0.05)，其均值分別為假手術對照組的9.4、2.2、13.7倍；而與模型組比較，BHG I治療組大鼠海馬的上述基因mRNA表達顯著下降(Plt;0.05)(見圖2)。

2.3 BHG I對大鼠海馬組織CA1區神經元超微結構的影響 使用透射電子顯微鏡觀察各組大鼠海馬CA1區神經元的超微結構，結果如圖3所示：假手術組大鼠海馬CA1區神經元胞核形態規則，染色質分布均勻(如圖3A箭頭所示)，線粒體及內

*表示與假手術組比較，Plt;0.05；#表示與模型組比較，Plt;0.05。 圖2 BHG I對大鼠海馬的IL-1β、COX-2、iNOS mRNA表達水平的影響

質網結構清晰；模型組大鼠海馬CA1區神經元超微結構受損，異染色質聚集(圖3B箭頭所示)，核周間隙明顯增寬，線粒體出現腫脹(圖3E中箭頭所示)；與模型組比較，治療組CA1區神經元超微結構損傷明顯減輕，線粒體及內質網結構清晰。

A、D:假手術組；B、C:模型組；C、F:BHG I治療組。(A、B、C圖箭頭所指為胞核內染色質及核周間隙，D、F箭頭所指為內質網和線粒體，E圖箭頭所指分別為線粒體和胞核內異染色質)。圖3 透射電鏡觀察BHG I對大鼠海馬CA1區神經元超微結構的影響

2.4 BHG I對炎癥相關蛋白表達水平的影響 通過Western blot實驗檢測大鼠海馬組織中IL-1β和TNF-α蛋白表達。結果發現(見圖4)，模型組海馬組織中IL-1β和TNF-α的蛋白表達較假手術組明顯升高(Plt;0.01)，而預防性給予BHG I后，大鼠海馬的IL-1β和TNF-α表達較模型組顯著下降(Plt;0.05)。

*表示與假手術組比較，Plt;0.05；#表示與模型組比較，Plt;0.05。圖4 BHG I對大鼠海馬的IL-1β和TNF-α蛋白表達水平的影響

3 討論

中樞炎癥反應在神經退行性疾病中起到重要作用。神經炎癥發生時小膠質細胞和星形膠質細胞被激活，伴隨大量促炎癥因子如細胞因子、粘附因子等的釋放，從而產生細胞毒性，導致神經元損傷、變性死亡[15-16]。LPS作為一種細菌內毒素，經側腦室注射后，可誘導小膠質細胞、星形膠質細胞等炎癥細胞被大量激活，釋放IL-1β、COX-2等炎癥反應介質，在24 h內使炎癥反應達到峰值，常被用于誘導急性炎癥動物模型[17-19]。因此本研究采用BHG I預防性給藥5 d后，LPS側腦室注射誘導急性神經炎癥模型觀察BHG I對模型大鼠的作用及機制。結果發現側腦室注射LPS 24 h后，大鼠的海馬結構被破壞，海馬CA1區神經元嗜酸性變性，且神經元超微結構明顯受損，炎癥因子IL-1β、COX-2、iNOS的mRNA表達水平及IL-1β和TNF-α的蛋白表達明顯上調，表明側腦室注射LPS誘導了大鼠急性神經炎癥模型。

BHG I為貴州省道地中藥材淫羊藿的主要成分，本課題組長期致力于淫羊藿藥理活性的研究。在寶藿苷I對鏈脲佐菌素所致的大鼠學習記憶減退模型中我們發現，寶藿苷I 3 mg/kg和10 mg/kg連續給藥21 d，僅10 mg/kg 寶藿苷I對模型大鼠顯示出治療作用[20]；在寶藿苷I對腦缺血再灌注損傷大鼠的作用研究中，我們則進一步發現預防性給予寶藿苷I 30 mg/kg，其療效明顯優于寶藿苷I 10 mg/kg劑量[21]。因此，在本實驗中，采用30 mg/(kg·d)這一最佳給藥劑量，觀察BHG I對急性神經炎癥的保護作用。通過細胞形態學檢測，發現BHG I預防性給藥明顯減輕了LPS導致的海馬CA1區神經元排列紊亂，變性以及超微結構的改變，緩解LPS誘導的神經元損傷。

為進一步探索BHG I改善LPS誘導的神經元損傷的作用機制，考察了BHG I對大鼠海馬組織中炎癥因子的mRNA及蛋白表達的影響。COX-2是炎癥級聯反應中的主要介質，可生成具有高效促炎介質的前列腺素,激活小膠質細胞形成炎癥環路[22-23]。IL-1β是一種促炎細胞因子，主要以以分泌形式發揮活性，其分泌型表達升高時，會抑制小膠質細胞的吞噬作用，加重炎癥反應[24]。TNF-α是一種涉及到系統性炎癥的細胞因子，存在無活性前體和分泌型兩種形式，其活性形式通常由巨噬細胞分泌產生，作為一種內源性致熱源，能夠誘發并加重炎癥反應。iNOS是催化一氧化氮產生的反應酶，其產物一氧化氮作為自由基產生神經毒性的同時也參與炎癥反應過程[25]。在我們的研究中發現，側腦室注射LPS后，大鼠海馬組織中的COX-2、IL-1β、iNOS的mRNA表達水平明顯增高，同時，我們檢測了分泌型活性IL-1β和TNF-α片段，發現IL-1β和TNF-α的蛋白表達顯著上調，而BHG I能明顯降低上述基因和蛋白的表達。提示BHG I預防性給藥可抑制海馬組織中炎癥因子的mRNA和蛋白過度表達。

綜上所述，本實驗證實BHG I可改善LPS誘導的急性神經炎性反應，緩解神經元損傷變性，其潛在機制與降低海馬組織中COX-2、IL-1β、iNOS的mRNA表達及IL-1β和TNF-α的蛋白表達有關。同時，在下一步的工作中，我們將進一步采用免疫組化，Western blot 等方法檢測小膠質細胞激活標志物及相關信號通路的變化，深入研究BHG I的作用機制，以期為BHG I的應用提供更全面的藥理學依據。

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[收稿2017-06-24;修回2017-08-17]

(編輯：譚秀榮)

基礎醫學研究

BaohuosideIattenuateshippocampalneuronaldamageinducedbyacuteneuroinflammationinrats

DengYuanyuan,GaoHu,ShiWanlan,LiFei

(Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education and Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine of Ministry of Education,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

ObjectiveTo explore the effects of Baohuoside I (BHG I) on lipopolysaccharide (LPS)-induced acute neuroinflammation in rats and its possible mechanisms.MethodsMale Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group (sham),model group and BHG I treated group.The treatment group was administered BHG I by gavage at the dose of 30 mg/kg once per day,sham group and model group was given an equal volume of saline.Five days after pretreatment with BHG I or saline,rats were anesthetized with chloral hydrate and secured in a stereotaxic apparatus.LPS (5 μg in 5 μL steriled in saline) was injected into left intracerebroventricular into the model and BHG I treated groups.The sham group underwent all surgical steps,with the exception that saline was administered rather than LPS.Animals were sacrificed 24 hours after the surgery,brain tissues were collected quickly for HE staining,transmission electron microscopy,real time RT-PCR analysis and western blot assay.ResultsBHG I administration significantly attenuated LPS-induced neuron disorders,CA1 region eosinophilic neuronal degeneration,karyopycnosis neurons and ultrastructural damage.meanwhile,BHG I reduced the over-expression of COX-2,IL-1β,iNOS mRNA and TNF-α,IL-1β protein in the hippocampus.ConclusionBHG I has a protective effect on LPS-induced acute neuroinflammation in rats.The mechanisms are due to the inhibition of the mRNA and protein expression of inflammatory factors.

Baohuoside I; lipopolysaccharide; inflammation; rat

貴州省科技廳聯合資金項目(NO：黔科合LH字[2015]7533)；貴州省衛生計生委科學技術基金項目(NO：gzwjkj2014-1-069)；遵義市科技局遵義醫學院聯合資金項目(NO：遵市科合社字[2016]29)。

李菲，女，博士，教授，碩士生導師，研究方向：神經藥理學，E-mail:lifei@zmc.edu.cn。

R965

A

1000-2715(2017)05-0516-06