辣椒素對大鼠胃動力的影響及作用機制

徐勁，唐川康，陽鳳，王縷，王瑤，彭燕

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州628000)

辣椒素對大鼠胃動力的影響及作用機制

徐勁，唐川康，陽鳳，王縷，王瑤，彭燕

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州628000)

目的探討辣椒素對大鼠胃動力的影響及其作用機制。方法選擇SD大鼠160只，隨機分為對照組及辣椒素低、中、高劑量組，每組40只。辣椒素低、中、高劑量組分別給予0.01、0.1、0.5 mg/mL的辣椒素溶液灌胃，對照組給予等量辣椒素溶劑灌胃。各組分別于灌胃3天及灌胃1、2、4周，隨機取10只，采用核素顯像法檢測胃半排空時間(t50%)、65 min時胃排空率(GE65 min)；處死后剖腹取胃，采用免疫組化二步法檢測胃組織辣椒素受體1(TRPV1)、降鈣素基因相關肽(CGRP)、P物質(SP)表達。結果辣椒素低、中、高劑量組各時間點較對照組同期t50%有升高趨勢，GE65 min有降低趨勢，均表現出抑制胃排空作用；辣椒素高、中劑量組各時間點抑制胃排空效果強于辣椒素低劑量組(P均<0.05)，辣椒素中、高劑量組抑制胃排空的效果相當(P均>0.05)。辣椒素低、中、高劑量組各時間點胃黏膜TRPV1表達均較對照組同期明顯增加(P均<0.05)，但辣椒素低、中、高劑量組之間比較差異無統計學意義(P均>0.05)。辣椒素低、中、高劑量組各時間點胃黏膜CGRP表達較對照組有升高趨勢；灌胃3天及1周，辣椒素高、中劑量組CGRP表達升高較辣椒素低劑量組更明顯(P均<0.05)。灌胃2、4周，辣椒素高、中劑量組胃黏膜CGRP表達顯著降低(P均<0.05)。辣椒素低、中、高劑量組各時間胃黏膜SP表達與對照組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。結論辣椒素具有抑制大鼠胃排空作用，且劑量越大，抑制效果越強；隨著作用時間延長，辣椒素劑量越大抑制胃排空效果減弱越明顯，其原因可能與胃黏膜CGRP大量消耗有關。

功能性胃腸??；胃腸道動力紊亂；辣椒素；辣椒素受體1；降鈣素基因相關肽；P物質

辣椒素是辣椒的主要活性成分，可選擇性刺激初級傳入神經元末梢和細胞膜上的辣椒素受體1(TRPV1)，參與胃腸道眾多的生理和病理過程。TRPV1陽性神經纖維含有多種神經遞質，如降鈣素基因相關肽(CGRP)、P物質(SP)等[1]。腸道CGRP主要分布于迷走神經和內臟神經的傳入纖維以及胃腸道壁內神經叢，對大部分胃腸運動具有抑制作用，可引起胃排空延遲[2]。SP是速激肽家族的一員，通過對胃平滑肌的直接作用刺激膽堿類神經元和作為非膽堿能神經興奮性神經遞質，加強胃腸道平滑肌的收縮運動[3]。因此認為，胃組織CGRP、SP表達改變可能與辣椒素抑制胃排空作用有關[4]。但目前辣椒素對胃腸道動力的影響及機制爭議較大。2015年5月～2016年2月，我們觀察了辣椒素對大鼠胃動力及胃組織TRPV1、CGRP、SP表達的影響?，F分析結果并報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD大鼠160只，清潔級，雌雄各半，2月齡，體質量160～180 g，由西南醫科大學動物實驗中心提供。KS400圖像處理系統，德國Zeiss公司；H3000WC型SPECT，德國西門子公司。辣椒素，純度99%，美國Sigma公司；實驗前稱取辣椒素1、10、50 mg，分別加入100 mL辣椒素溶劑(10%吐溫20 mL+10%酒精1 mL+生理鹽水79 mL)，充分溶解，獲得終濃度為0.01、0.1、0.5 mg/mL的辣椒素溶液。99mTc-DTPA，由西南醫科大學核醫學科提供；兔抗大鼠TRPV1、CGRP、SP多克隆抗體及生物素標記二抗試劑盒，北京博奧森生物技術有限公司；DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物分組處理 所有大鼠適應性飼養1周，隨機分為對照組及辣椒素低、中、高劑量組，每組40只。辣椒素低、中、高劑量組分別給予0.01、0.1、0.5 mg/mL濃度的辣椒素溶液2 mL灌胃，對照組給予等量辣椒素溶劑灌胃。

1.3 相關指標觀察 各組分別于灌胃3天及灌胃1、2、4周隨機取10只，檢測以下指標。

1.3.1 胃半排空時間(t50%)及65 min時胃排空率(GE65 min) 采用核素顯像法。①標準餐制備：取99mTc標記的DTPA 1.2 mci，加入12 mL生理鹽水，并與12 g芝麻糊混合，振蕩10 min，獲得每毫升含有99mTc-DTPA 0.1 mci的半固體標準餐。②標準餐灌胃：大鼠禁食24 h、禁水6 h，不禁藥，末次灌胃后10 min，標準餐2 mL灌胃。③圖像采集：低能通用型準直器參數：能峰140 keV，窗寬20%，矩陣128×128；標準餐灌胃后，將大鼠俯臥位固定于固定器中，使胃和大部分小腸置于探頭視野中。灌胃后5、10、15、20 min各采集圖像1幀，隨后每15 min采集圖像1幀，每幀圖像采集60 s，連續觀察2 h。若2 h內放射性計數尚未下降50%，可繼續延長觀察時間。④圖像處理：CT圖像斷層融合：采集的CT圖像斷層數據經OSEM迭代重建后，使用GE專用Functional anatomical fusion融合處理軟件與CT圖像進行融合，重建橫斷面、矢狀面、冠狀面SPECT/CT融合圖像，輔助診斷軟件設定感興趣區，獲得各時間點全胃內放射性計數，繪制時間-放射性曲線。根據時間-放射性曲線即可獲得t50%及胃排空試驗第65 min時胃內放射性核素計數，計算65 min時胃排空率(GE65 min)。計算公式：GEt=(Cmax-Ct)/Cmax×100%[GEt為某時點的胃排空率；Cmax為胃區內最大計數率；Ct為某時點的胃內計數率(經衰變校正和衰減校正后)]。

1.3.2 胃體組織TRPV1、CGRP、SP表達 采用免疫組化二步法。胃排空檢測完畢后采用3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后處死，迅速剖腹取胃。取胃體組織，甲醛固定，石蠟包埋，5 μm厚切片；60 ℃恒溫箱烤片過夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；3%過氧化氫甲醛液室溫孵育10 min，PBS沖洗5 min×3次；檸檬酸緩沖液高壓蒸煮5 min，自然冷卻至室溫，PBS沖洗5 min×3次；滴加適量相應一抗(兔抗大鼠TRPV1、CGRP、SP多克隆抗體，稀釋效價均為1∶100)，4 ℃孵育過夜。次日，PBS沖洗5 min×3次，滴加適量生物素標記的二抗，室溫孵育30 min，蒸餾水沖洗3 min，TBST洗膜5 min。DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸分化，常規脫水，透明，干燥，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。TRPV1、CGRP、SP陽性表達主要位于胞質內，呈黃色顆粒狀。光鏡下選擇切片的陽性區域，隨機取3個400倍視野，采用彩色病理圖像分析軟件測定3個視野內陽性信號的面積和陽性信號平均光密度值，計算陽性指數(PI)。PI=陽性信號面積×陽性信號平均光密度值/測定面積。PI越大，表明TRPV1表達或CGRP、SP釋放越多。

2 結果

2.1 各組不同時間t50%、GE65 min比較 見表1。

2.2 各組胃體組織TRPV1、CGRP、SP表達比較 見表2。

表1 各組不同時間t50%、GE65 min比較

注：與對照組同期比較，*P<0.05；與辣椒素低劑量組同期比較，#P<0.05；與辣椒素中劑量組同期比較，☆P>0.05；與同組灌胃3天比較，△P<0.05；與同組灌胃1周比較，▲P<0.05；與同組灌胃2周比較，▽P<0.05。

表2 各組不同時間胃體組織TRPV1、CGRP、SP表達比較

注：與對照組同期比較，*P<0.05；與辣椒素低劑量組同期比較，#P<0.05；與同組灌胃3天比較，△P<0.05；與同組灌胃1周比較，▲P<0.05；與同組灌胃2周比較，▽P<0.05。

3 討論

研究發現，辣椒素通過作用于胃腸道黏膜上皮細胞的TRPV1，引發一系列生物學效應，繼而促進胃黏膜屏障修復、調節胃腸道動力等[5]。但辣椒素的藥理作用特殊，可產生刺激興奮、感覺阻滯、選擇性神經毒性損害和不可逆性細胞破壞四種藥理效應。初次或小劑量辣椒素作用于傳入神經纖維，可使該神經纖維出現一過性興奮，釋放某些神經遞質，并向上級神經元傳遞信號，即為刺激興奮效應。當繼續或反復使用辣椒素，使興奮的神經纖維消耗大量遞質，導致對刺激無反應，出現脫敏現象，即為感覺阻滯效應。大劑量辣椒素在引起初級刺激興奮作用后，可引起神經遞質的過量釋放，導致傳入神經纖維受到嚴重損害，失去其信息傳入功能，即為選擇性神經毒性損害效應，甚至不可逆性細胞破壞。說明劑量和作用時間不同，辣椒素所表現出的藥理效應亦不相同[6～10]。但目前關于辣椒素影響胃動力的量效關系、時效關系尚不完全清楚。

本課題組前期研究發現，1～10 mg/(kg·d)辣椒素灌胃對大鼠胃腸道的敏感性影響較小，故本研究選擇0.1、1、5 mg/(kg·d)三種劑量辣椒素灌胃。結果顯示，與對照組灌胃同期比較，辣椒素低、中、高劑量組各時間點t50%有升高趨勢，GE65 min有降低趨勢，均表現出胃排空抑制作用。但不同劑量辣椒素灌胃≤1周所表現出的抑制效果強度不同：辣椒素中、高劑量組抑制胃排空作用強于辣椒素低劑量組，而辣椒素中、高劑量組抑制胃排空效果相當。本課題組前期研究發現，1 mg/(kg·d)辣椒素灌胃1～7天，大鼠內臟化學刺激敏感性逐漸增強，灌胃2周后基本恢復正常[11]。推測辣椒素的藥理作用隨著時間延長，可能出現耐受，導致藥理作用減弱甚至消失。本研究結果顯示，隨著作用時間延長，辣椒素中劑量組t50%逐漸降低，至灌胃4周，胃排空抑制作用基本消失；辣椒素高劑量組亦隨時間延長，抑制胃排空作用逐漸減弱，灌胃2周抑制胃排空作用基本消失。雖然整個實驗過程辣椒素低劑量組均表現為胃排空抑制作用，但仍有隨著時間延長，抑制效應逐漸減弱的趨勢。因此認為，辣椒素的藥理效應具有時間及劑量依賴性，與Szolcsanyi[12]報道基本一致。

消化道內有豐富的傳入神經纖維和TRPV1分布，約50%的迷走傳入神經支配的大鼠胃腸道有TRPV1表達。辣椒素通過傳入神經纖維激活胃腸道TRPV1后鈣離子通道開放，引起神經元及其纖維釋放神經遞質，從而調節胃腸道動力。有研究發現，1 mg/(kg·d)辣椒素灌胃不同時間，大鼠胃組織TRPV1表達明顯不同[13]。既往研究多在病理條件下觀察胃黏膜TRPV1表達改變[14]，對長時間使用辣椒素藥物本身是否影響TRPV1表達研究較少。本研究結果顯示，與對照組灌胃同期比較，辣椒素低、中、高劑量組胃黏膜TRPV1表達均明顯增加，但各辣椒素組間比較差異無統計學意義。推測辣椒素可上調正常大鼠胃黏膜TRPV1表達，但與辣椒素劑量和作用時間無關，尚不能確定大鼠胃排空改變與胃黏膜TRPV1上調有關。

胃腸道CGRP主要分布于迷走神經和內臟神經的傳入纖維以及胃腸道壁內神經叢，對辣椒素作用敏感。CGRP對大部分胃腸運動起抑制作用，引起胃底縱行肌、胃竇部環形肌松弛，胃內壓下降，引起胃排空延遲，抑制胃腸運動。SP廣泛分布于腸神經系統和整個胃腸道，可直接作用于平滑肌或間接通過釋放乙酰膽堿，引起胃腸平滑肌收縮，促進胃腸道運動。本研究結果顯示，辣椒素高劑量組灌胃3天及灌胃1周胃黏膜CGRP表達較對照組明顯增加，但灌胃2、4周胃黏膜CGRP表達與對照組比較差異無統計學意義；辣椒素中劑量組灌胃3天及灌胃1、2周胃黏膜CGRP表達較對照組明顯增加，而灌胃4周胃黏膜CGRP表達與對照組比較差異無統計學意義；辣椒素低劑量組灌胃3天及灌胃1、2、4周胃黏膜CGRP表達較對照組均有所增加。說明辣椒素引起的大鼠胃黏膜CGRP表達改變可能具有劑量和時間依賴性。推測辣椒素灌胃早期導致大鼠胃黏膜CGRP釋放，繼而引起胃動力抑制、胃排空減慢，隨著時間延長，胃黏膜CGRP消耗，抑制胃動力效應消失。De Winter等[15]研究發現，1.6 mmol/L辣椒素溶液灌胃可降低50%胃肌電活動，明顯延遲胃排空；胃灌流液中CGRP含量是SP的100倍，持續CGRP灌注同樣可抑制胃肌電活動，而CGRP拮抗劑可抵消辣椒素溶液灌胃所致的胃排空延遲。本研究結果顯示，各組胃黏膜SP表達極少，且其表達不受辣椒素灌胃的影響。

綜上所述，辣椒素具有抑制大鼠胃排空作用，且劑量越大，抑制作用越強；隨著作用時間延長，劑量越大，抑制胃排空效應減弱越明顯，其原因可能與胃黏膜CGRP大量消耗有關。

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彭燕(E-mail： 1806857826@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.010

R573

A

1002-266X(2017)40-0035-04

2016-09-04)