含輔酶Q10和洛伐他汀的紅曲膠囊對老年性骨質疏松大鼠腰椎骨丟失的改善作用

呂思敏+于瓊+司徒永立+孫金影+崔燎+吳鐵

[摘要]目的 評價含有輔酶Q10以及洛伐他汀的紅曲膠囊對老年性骨質疏松模型腰椎骨骨藥理學的作用。方法 采用3月齡SPF級雌性SD大鼠45只，根據體重隨機分為5組：假手術組（CON組），去卵巢組（OVX組），模型組（MOD組），己烯雌酚組（DES組）以及紅曲膠囊組（RYR組），每組9只。取材前第13、14天和第3、4天進行皮下注射7 mg/kg鈣黃綠素進行骨熒光標記。給藥60 d后，取第四腰椎進行Micro CT掃描，之后制成不脫鈣的骨切片，進行骨形態計量學檢測。結果 與CON比較，MOD組Micro CT指標：骨體積分數（BV/TV），骨小梁厚度（Tb.Th），骨小梁數量（Tb.N），連接密度（Conn-Dens）以及骨密度（Density）均顯著下降（P < 0.01），而骨小梁分離度（Tb.Sp）和結構模型指數（SMI）顯著增大（P < 0.01）；形態計量學參數：骨小梁面積百分數（%Tb.Ar）和Tb.N均顯著降低（P < 0.01），而Tb.Sp和破骨細胞周長百分率（%Oc.Pm），單位骨小梁面積破骨細胞數（Oc.N），以及骨形成率（BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV）和熒光周長百分數（%L.Pm）均顯著增加（P < 0.01）。與MOD組比較，RYR組Micro CT指標：BV/TV，Tb.Th，Tb.N，Conn-Dens以及Density均顯著增加（P < 0.01），而Tb.Sp和SMI均顯著降低（P < 0.01）；形態計量學參數：%Tb.Ar和Tb.N均顯著增加（P < 0.01），而Tb.Sp和%Oc.Pm，Oc.N以及BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV和%L.Pm均顯著下降（P < 0.01）。結論 去卵巢合并D-半乳糖可導致大鼠出現老年性骨質疏松癥狀，含輔酶Q10和洛伐他汀的紅曲膠囊改善去卵巢合并D-半乳糖致大鼠腰椎骨丟失效果顯著。

[關鍵詞] 輔酶Q10；洛伐他??；紅曲；去卵巢；D-半乳糖

[中圖分類號] R965 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）11（a）-0031-06

Effect of Red Yeast Rice Capsules containing coenzyme Q10 and Lovastatin on lumbar vertebral in elderly osteoporosis rats

LV Simin1 YU Qiong2 SITU Yongli2 SUN Jinying2 CUI Liao2 WU Tie1，2▲

1.Guangdong Medical University·Guangdong Runhe Biological Technology Co.， Ltd. Coenzyme Q10 Research Institute， Guangdong Province， Dongguan 523808， China； 2. School of Pharmacy， Guangdong Medical University， Guangdong Province， Dongguan 523808， China

[Abstract] Objective To investigate the effects on lumbar of Red Yeast Rice Capsules containing coenzyme Q10 and Lovastatin in elderly osteoporosis rats. Methods 45 three-month old female Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group （CON group）， ovariectomized group （OVX group）， model group （MOD group）， diethylstilbestrol group （DES group）， and Red Yeast Rice Capsules group （RYR group） according the weigh， and each group of 9 rats. All rats were received subcutaneous injection of calcein （7 mg/kg） on day 14， day 13， and day 4， day 3 before drawing the tissue samples. After 60 days， the fourth lumbar was performed on Micro CT， and then was measured in undecalcified sections for static and dynamic histomorphometric analysis. Results Compared with the CON group， in MOD group the Micro CT indexes of BV/TV， Tb.Th， Tb.N， Conn-Dens， Density decreased significantly （P < 0.01）， Tb.Sp and SMI increased significantly （P < 0.01）， and the histomorphometry indexes of %Tb.Ar and Tb.N were reduced significantly （P < 0.01）， but Tb.Sp， %Oc.Pm， Oc.N， BFR/BS， BFR/BV， BFR/TV， %L.Pm， increased significantly （P < 0.01）. Compared with the MOD group， in RYR group BV/TV， Tb.Th， Tb.N， Conn-Dens， Density increased significantly （P < 0.01）， Tb.Sp and SMI were reduced significantly （P < 0.01）， and the histomorphometry indexes of %Tb.Ar， Tb.N increased significantly （P < 0.01）， while Tb.Sp， %Oc.Pm， Oc.N， BFR/BS， BFR/BV， BFR/TV， %L.Pm decreased significantly （P < 0.01）. Conclusion The bone loss was less significant and serious degradation of the bone microstructure were observed in lumbar vertebralin the rats treated with ovariectomy combined with D-galactose. Red yeast rice capsules containing coenzyme Q10 and Lovastatin showed effective prevention effects on osteoporosis induced by ovariectomy combined with D-galactose in rats.endprint

[Key words] Coenzyme Q10； Lovastatin； Red yeast rice； Ovariectomy； D-galactose

骨質疏松癥是一種以低骨量和骨組織微結構破壞為特征、導致骨脆性增加、骨折危險性增加的全身性疾病，這種低骨量和微結構破壞在脊柱的表現較在外周骨更早、更為廣泛[1]。去卵巢后由于雌激素的缺乏導致骨量的快速丟失，而D-半乳糖在代謝中產生過多的自由基可以破壞膠原蛋白形成，從而影響骨的代謝[2-3]，造成老年骨質疏松。因此，去卵巢合并D-半乳糖可作為一種新的骨質疏松動物模型[4]，模擬65歲以上婦女的“老年性骨質疏松”。輔酶Q10可以調節成骨細胞和破骨細胞的分化[5]，可以增加骨密度，他汀類藥物在抗骨質疏松的治療中起到積極作用，而且輔酶Q10可以有效減輕和預防他汀類藥物對橫紋肌、肝的副作用而起到協同的作用[6]。因此，本研究把紅曲中的他汀成分及紅曲菌絲體中的輔酶Q10提取出來后，按傳統的膠囊生產工藝，制備為“紅曲膠囊”，采用大鼠去卵巢合并D-半乳糖誘導老年性骨質疏松模型的椎骨，對其進行評價，探討其抗骨質疏松的骨藥理作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

45只SPF級3月齡SD大鼠，雌性，體質量（231.11±18.96）g。由廣東省中山大學實驗動物中心提供，實驗動物質量合格證號：SCXK（粵）2011-0029。動物實驗研究遵循了廣東醫科大學所制定的有關實驗動物保護和使用的指南，并經廣東醫科大學的實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥品與試劑

紅曲膠囊由廣東醫科大學湛江廣醫醫藥科技開發有限公司提供（每粒紅曲膠囊含有1.31 mg洛伐他汀，6.28 μg輔酶Q10）；D-半乳糖由天津市光復精細化工研究所提供（批號：20120928）；己烯雌酚注射液由上海通用制藥股份有限公司提供（批號：100204）；甲苯胺藍和鈣黃綠素購于美國Sigma公司。

1.3 儀器與設備

Micro CT儀（SCANCO Medical AG，瑞士）；光學顯微鏡（Nikon，日本）；熒光顯微鏡和顯微照相機（Nikon，日本）；Osteomeasure測量和分析系統（Osteo Metrics，Inc. USA）；硬組織切片機；碳化鎢鋼刀；慢速鋸；賽多利斯BT 25S電子天平；石膏打磨機；恒溫磁力攪拌器；電熱恒溫鼓風干燥箱。

1.4 實驗方法

45只SD大鼠經適應性飼養1周，之后根據體重隨機分成5組，每組9只。分組情況：①假手術組（CON）：5 mL/（kg·d）蒸餾水灌胃；②去卵巢組（OVX）：雙側去卵巢后，5 mL/（kg·d）蒸餾水灌胃；③模型組（MOD）：雙側去卵巢后，100 mg/（kg·d）D-半乳糖皮下注射；④己烯雌酚組（DES）：同模型組造模，給予30 μg/（kg·d）己烯雌酚灌胃；⑤紅曲膠囊組（RYR）：同模型組造模，給予0.5 顆/（kg·d）紅曲膠囊灌胃。每組大鼠均自由飲水和攝食，連續給藥60 d。所有的大鼠在取材前的第13、14天和第3、4天皮下注射7 mg/kg的鈣黃綠素各1次，進行骨熒光標記。大鼠的體重每周稱1次，并依照體重的變化來調整給藥的劑量。取材時，腹腔注射給予3%戊巴比妥鈉（1.5 mL/kg）麻醉大鼠，并且右心室徹底抽血以處死大鼠。之后取第四腰椎進行Micro CT掃描，再將第四腰椎制成不脫鈣的骨切片進行骨組織形態計量學的研究。

1.5 大鼠腰椎的測定方法

1.5.1 大鼠腰椎的Micro CT檢測及分析方法 大鼠處死后，迅速取出第四腰椎，置于4%多聚甲醛中，24 h后換上75%乙醇浸泡。將處理好的第四腰椎放入Micro CT儀，對腰椎進行X線掃描。掃描條件為：電壓70 kVp，電流114 μA，掃描時間為24.8 min（單層），間隔時間為200 ms，分辨率為中度（Medium）。掃描同一樣品，進行角度為180°的投射，獲得1024×1024像素的500張不同截面的圖片。對于腰椎選取矢狀面兩側骨骺線下0.5 mm之間的次級松質骨作為興趣區域（ROI），并進行三維重建。圖像二值化完成之后，對選定ROI內的松質骨進行三維可視化呈現。使用其軟件進行定量分析，參數包括：骨體積分數（BV/TV），骨小梁分離度（Tb.Sp），骨小梁厚度（Tb.Th），骨小梁數量（Tb.N），連接密度（Conn-Dens），骨密度（Density）以及結構模型指數（SMI）等[7]。

1.5.2 大鼠腰椎骨組織形態計量學檢測方法 將Micro CT掃描后的第四腰椎用慢速據沿額狀面鋸開干骺端，暴露骨髓腔，按照文獻進行脫水、透明、滲透，包埋，切片，染色，封片，制成不脫鈣骨切片，以矢狀面兩側骨骺線下0.5 mm之間的次級松質骨為觀察范圍，測量松質骨骨組織形態計量學參數。用半自動的圖象數字化儀直接測量出的參數后，根據國際通用公式進行計算分析，包括靜態參數：骨小梁面積百分數（%Tb.Ar），Tb.Sp，Tb.N，Tb.Th；動態參數：骨形成率（BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV），骨礦化沉積率（MAR），熒光周長百分數（%L.Pm）；吸收參數：破骨細胞周長百分率（%Oc.Pm），單位骨小梁面積破骨細胞數（Oc.N）[8]。

1.6 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用ANOVA單因素方差分析，若Levene檢驗方差齊性，則組間采用LSD檢驗；若方差不齊則采用Welch校正后做方差分析，組間采用Dunnett′s T3多重檢驗；以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 含輔酶Q10和洛伐他汀的紅曲膠囊對去卵巢合并D-半乳糖誘導的老年性骨質疏松大鼠腰椎骨形態的影響endprint

2.1.1 Micro CT掃描ROI區三維重建圖的變化 圖1中A為CON組，從圖中可見動物骨小梁的結構比較緊密，骨小梁的粗細比較均勻，而且骨小梁的連續性比較好；B為OVX組，可見該組骨小梁出現斷裂、變短，并且骨小梁之間有較大的空隙；C為MOD組，可見該組動物的骨小梁變短，且斷裂，有很大的空隙；D為DES組，圖中可見動物骨小梁較MOD組明顯地增粗，數量明顯增多，而且緊密性較好，一定程度上恢復連續性；E為RYR組，該組動物的骨小梁排列均勻緊密有序，且骨小梁之間間隙較小，連續性好，在小梁骨的數量、厚度、以及分布上均較MOD組有明顯的改善。

2.1.2 Micro CT掃描指標的變化 與CON組比較，MOD組的BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Conn-Dens、Density均顯著降低（P < 0.01），Tb.Sp和SMI均顯著升高（P < 0.01）。而與MOD組比較，DES組的BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Conn-Dens、Density均顯著增加（P < 0.01），Tb.Sp明顯降低（P < 0.05）和SMI顯著降低（P < 0.01）；RYR組的BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Conn-Dens、Density指標均顯著增加（P < 0.01），Tb.Sp和SMI均顯著降低（P < 0.01）。與DES組比較，RYR組的Tb.N明顯地增加（P < 0.05）。以上結果提示，去卵巢合并D-半乳糖可以導致大鼠的腰椎骨量大量丟失，紅曲膠囊可有效地預防骨丟失。見表1。

2.2 含輔酶Q10和洛伐他汀的紅曲膠囊對去卵巢合并D-半乳糖誘導的老年性骨質疏松大鼠腰椎骨形態計量學的影響

2.2.1 形態計量學靜態參數和吸收參數的變化 與CON組比較，MOD組的%Tb.Ar和Tb.N顯著降低（P < 0.01），Tb.Sp和%Oc.Pm、Oc.N顯著增大（P < 0.01），以上說明模型組大鼠的腰椎松質骨骨小梁的數量顯著減少，骨小梁的微觀結構嚴重退化，并且破骨細胞的破骨作用很強。與MOD組比較，DES組的%Oc.Pm明顯降低（P < 0.05）；RYR組的%Tb.Ar、Tb.N顯著性增加（P < 0.01），Tb.Sp和%Oc.Pm、Oc.N顯著降低（P < 0.01）。與DES組比較，RYR組的%Tb.Ar、Tb.N顯著性增加（P < 0.01），Tb.Sp和%Oc.Pm、Oc.N顯著降低（P < 0.01）。以上結果提示，紅曲膠囊可以有效地對抗去卵巢合并D-半乳糖對大鼠腰椎骨小梁數量的減少以及骨顯微結構的破壞，并且能有效地抑制破骨細胞的破骨作用。見表2。

2.2.2熒光標記的動態變化 圖2（封四）中A為CON組，該組的動物腰椎骨片熒光較稀疏。B為OVX組，該組熒光較CON多，且明亮，有雙熒光。C為MOD組，該組動物的熒光較CON組豐富，綠色的鈣黃綠素熒光清晰可見，而且雙熒光清晰明亮，說明骨形成較活躍，促骨形成的作用較強。D為DES組，熒光較MOD組少，有雙熒光。E為RYR組，熒光均較MOD少，熒光零星點點，說明骨形成不活躍，促骨形成作用較弱。

2.2.3 形態計量學動態參數的變化 與CON組比較，MOD組的BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV和%L.Pm均顯著升高（P < 0.01），以上提示去卵巢合并D-半乳糖可使得動物的促骨形成作用和促骨礦化能力增強，為高骨轉換率，但其骨吸收作用遠遠大于骨形成作用，因而出現骨丟失。與MOD組比較，DES組的上述指標差異均無統計學意義（P > 0.05）；RYR組的BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV和%L.Pm均顯著性降低（P < 0.01）。另，與DES組比較，RYR組的%L.Pm明顯降低（P < 0.05），而BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV均顯著性降低（P < 0.01）。見表3。說明紅曲膠囊組動物腰椎松質骨的骨形成作用較弱。

3 討論

3.1 去卵巢合并D-半乳糖可致大鼠腰椎出現明顯的骨質疏松

本實驗研究發現，去卵巢合并D-半乳糖可導致大鼠腰椎的BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Density和Conn-Dens均顯著降低，Tb.Sp和SMI均顯著增加，骨小梁斷裂，變短，并出現很大的間隙，表明去卵巢合并D-半乳糖大鼠骨小梁的結構明顯稀疏，骨量嚴重丟失，骨微結構明顯破壞，骨質疏松癥狀顯著。而且，去卵巢合并D-半乳糖大鼠腰椎的%Tb.Ar和Tb.N降低，Tb.Sp、Oc.N和%Oc.Pm均增加，該組熒光豐富，綠色的鈣黃綠素熒光清晰可見，而且雙熒光清晰明亮，表明該組動物腰椎骨量丟失嚴重、骨微結構退化嚴重，破骨細胞數量增加，活性增強，破骨細胞的吸收作用增強，間接提示溶解骨質的速度加快，提示去卵巢合并D-半乳糖可明顯促進大鼠的骨形成的作用和礦化的作用，屬于高骨轉換率，但由于骨吸收作用遠遠大于骨形成作用，使得骨重建處于負平衡狀態，從而出現骨丟失嚴重。

去卵巢合并D-半乳糖使得大鼠的腰椎骨骨代謝發生異常改變：骨量丟失嚴重，破骨細胞的破骨作用活動增強，雖然成骨細胞促進骨形成的功能代償性增強，但由于破骨細胞的破骨作用遠遠大于成骨細胞的成骨作用，從而使得骨重建處于負平衡而出現骨丟失嚴重。這是以骨吸收為主的高轉換型骨代謝，骨量明顯減少，骨組織形態學以及超微結構受到嚴重破壞。當雌激素下降時，高骨轉換導致松質骨丟失嚴，而D-半乳糖可使骨形成受到抑制，促進了骨吸收，骨轉換率明顯的降低，出現“骨形成不足”的骨丟失，即低轉換型骨質疏松，但在本實驗中，可觀察到去卵巢合并D-半乳糖的大鼠腰椎骨轉換為高轉換型，可能是因為雙側去卵巢之后，雌激素驟停，直接刺激了骨吸收，從而引起骨形成代償性增加，其作用強于D-半乳糖所起的作用。

3.2 紅曲膠囊可改善去卵巢合并D-半乳糖大鼠腰椎的骨質疏松

Micro CT是檢測骨微結構的有效手段，當BV/TV、Tb·Th、Tb·N、Conn·D降低，而Tb·Sp增加時，提示骨量減少，骨小梁變薄、變細、變稀疏，骨微結構退化[9]。與模型組比較，紅曲膠囊組的Micro CT參數BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Density、Conn-Dens指標均顯著增加，Tb.Sp、SMI均顯著降低；且骨小梁分布排列均勻有序，緊密，且空隙較小，連續性比較好，說明紅曲膠囊能增加腰椎骨量，并且增加骨小梁數量的效果比己烯雌酚好，提示紅曲膠囊有抵抗去卵巢合并D-半乳糖導致大鼠腰椎骨量丟失的作用。endprint

Micro CT可精確顯示骨組織三維結構特征，但難以獲取并反映骨組織局部的細胞形態和骨形成率、吸收率等變化參數[10]。從骨形態計量學參數可見，紅曲膠囊組腰椎%Tb.Ar和Tb.N增加，Tb.Sp降低，并且Oc.N和%Oc.Pm均降低，說明紅曲膠囊可減少破骨細胞數量和/或減弱破骨細胞破骨功能，表明紅曲膠囊能有效地抑制破骨細胞的活性，從而起到預防去卵巢合并D-半乳糖對大鼠腰椎松質骨顯微結構的破壞的作用 。

紅曲膠囊含有洛伐他汀和輔酶Q10，他汀類和輔酶Q10均具有促成骨潛能。他汀類藥物可增加BMP-2表達和活性，促進骨形成及骨的礦化[11]；也可通過抑制骨髓多能干細胞成的脂分化，促進骨形成；還可通過降低血清IL-6的分泌水平，抑制骨吸收[12]。另外，他汀類可以促進前成骨細胞、胚胎干細胞、牙周膜細胞等多種細胞的成骨分化[13-14]。劉家寅等[15]研究發現，在缺乏成骨誘導成分的環境下，辛伐他汀可以通過活化p38MAPK信號誘導大鼠BMSCs向成骨細胞分化。本課題組發現[16]，洛伐他汀可使CCl4致肝損傷的小鼠增加骨密度，修復骨的顯微結構。輔酶Q10是一種具有強大的清除自由基作用的抗氧化劑，本課題組成員[17]在輔酶Q10對10月齡小鼠股骨的Micro CT觀察及骨生物力學檢測的研究中，發現輔酶Q10能夠修復小鼠的股骨微觀結構，提高骨生物力學的性能，修復骨量、降低股骨骨折風險。

骨轉換是指由破骨細胞侵蝕舊骨釋放出骨鈣的骨吸收作用和由成骨細胞分泌膠原物質，促進類骨質礦化形成新骨的骨形成作用[18]。成骨細胞的成骨作用與破骨細胞的破骨作用維持著動態平衡，對骨代謝有著關鍵作用[19-20]，因此，提高成骨細胞分化活性，同時降低破骨細胞的活性，是預防和治療骨質疏松的重要靶點。本實驗發現，紅曲膠囊主要是通過抑制破骨細胞而起抗骨丟失作用。隨著年齡的增長和去卵巢后雌激素的缺乏，血液和組織中輔酶Q10水平不斷降低，因此，補充輔酶Q10可有效減輕和預防他汀類藥物對橫紋肌、肝的副作用，而且輔酶Q10和洛伐他汀同時具有抗骨丟失的作用，起到協同作用。

去卵巢合并D-半乳糖可致大鼠腰椎骨量嚴重丟失，骨顯微結構嚴重退化，給予含輔酶Q10和洛伐他汀的紅曲膠囊后，去卵巢合并D-半乳糖大鼠腰椎骨丟失情況和骨微結構均得到改善，提示該膠囊具有良好的抗骨質疏松作用。

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（收稿日期：2017-08-15 本文編輯：任 念）endprint