紅壤丘陵區旱地和水旱輪作地土壤中纖維素降解功能微生物群落特征

王雨晴 ，陳香碧 ，董明哲 ，馮書珍 ，3，胡亞軍 ，蘇以榮 ，葛體達 ，張振華 ，李巧云

紅壤丘陵區旱地和水旱輪作地土壤中纖維素降解功能微生物群落特征

王雨晴1，2，陳香碧2*，董明哲2，馮書珍2，3，胡亞軍2，蘇以榮2，葛體達2，張振華4，李巧云1*

（1.湖南農業大學生物科技學院，長沙 410128；2.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，亞熱帶農業生態重點實驗室，長沙 410125；3.廣西科技大學，廣西 柳州 545006；4.湖南農業大學南方糧油作物協同創新中心，長沙 410128）

為揭示農田土壤有機質中纖維素降解的微生物機制，依托紅壤丘陵區長期定位試驗，以兩種土地利用方式（旱地和水旱輪作地）下兩種施肥模式（化肥、秸稈還田配施化肥）的農田生態系統為研究對象，分析了表層土壤中纖維素含量、纖維二糖水解酶活性以及纖維素降解功能微生物豐度與群落結構的周年動態變化特征。結果表明：長期（13年）施肥后土壤中纖維素并未發生顯著積累，且從周年動態變化來看，秸稈還田后旱地和水旱輪作地中纖維素分別在6個月和3個月內完全降解或被轉化為其他形態；相關分析表明，纖維二糖水解酶活性與纖維素含量呈顯著正相關，而真菌cbhI基因豐度與纖維二糖水解酶呈顯著正相關（p＜0.01），因此功能基因cbhI可用于指示本研究供試土壤中降解纖維素的關鍵微生物群；聚類分析表明，旱地和水旱輪作地的纖維素降解微生物（含cbhI基因）互相分離，即與施肥相比，土地利用方式是引起土壤中纖維素降解微生物群落組成改變最主要的因素；克隆測序結果顯示，兩種土地利用方式下纖維素降解功能微生物均以傘菌和糞殼菌占絕對優勢，分別占總克隆庫的22.9%～39.5%（平均為34.7%）和17.7%～42.3%（平均為28.5%），其中秸稈還田后的纖維素降解過程可能由糞殼菌主導。研究結果闡明了紅壤丘陵區旱地和水旱輪作地中秸稈還田后纖維素降解及其功能微生物群落的異同，為揭示農田土壤新鮮有機質中易分解組分（纖維素）的微生物轉化機制提供了基礎數據。

纖維素；旱地；水旱輪作地；纖維二糖水解酶；微生物群落

纖維素是D-葡萄糖以β-1，4糖苷鍵聯結而成的線形大分子多糖，大約30個糖鏈合成一個小纖維單元，然后聚集成微纖維，最后聚集成纖維。纖維素是地球上含量最豐富的碳水化合物，占到植物干重的35%～50%[1]。自然條件下，纖維素通過植物凋落物進入土壤系統，參與土壤碳循環和碳固定過程。農田是最活躍的土壤碳庫之一，秸稈還田是農田土壤固碳以及生產力維持的重要措施[2]。作為秸稈中含量最高的組分，纖維素在農田土壤碳轉化積累過程中占有非常重要的地位。

天然纖維素的微生物降解機理，普遍接受的理論——協同理論認為纖維素酶對纖維素的降解過程是：內切葡聚糖酶首先進攻纖維素的非晶區，形成外切葡聚糖纖維二糖水解酶需要的新的游離末端，然后外切纖維素酶從多糖鏈末端切下纖維二糖單位，β-葡萄糖苷酶再水解纖維二糖單位形成葡萄糖[3]。纖維二糖水解酶是纖維素降解的一種重要的外切酶，常被用于表征纖維素降解的關鍵酶[4-5]。不同微生物分泌酶的編碼基因可能不同，如纖維二糖水解酶的編碼基因有真菌 cbhI、cbhII、細菌 cel5 等[6-7]。其中，cbhI基因編碼的外切葡聚糖酶（CBHⅠ酶）負責切割纖維素分子還原端糖苷鍵。目前，cbhI已被國內外許多學者廣泛用于指示纖維素降解的微生物功能基因[5，8-9]。以往，環境樣品中纖維素微生物降解過程研究主要依賴于純培養技術且針對單個菌株。研究人員已從不同農田生態系統中分離到降解纖維素的細菌和真菌，例如：景音娟等[10]發現，秸稈還田土壤中纖維素降解菌Streptomycetaceae、Flavobacterium、Sphingobium 相對豐度明顯多于對照處理；傅筱沖等[11]從稻田土壤中分離的三種纖維素降解真菌：鐮刀菌Fusarium sp，青霉菌Penicillium sp，枝頂孢霉菌Acremonium sp。然而，自然界中99%以上的微生物不可純培養，采用基于PCR擴增的分子生物學技術（T-RFLP、DGGE、克隆、高通量測序）可較為全面地反映環境樣品中降解纖維素的微生物功能群[7]?；赥-RFLP技術的研究發現，長期不同施肥處理下（礦質肥、糞肥）纖維二糖水解酶活性與cbhI基因多樣性呈顯著正相關[5]?；赗FLP技術的研究發現，我國黃淮海平原典型潮土中纖維素降解菌（cbhI基因）分別屬于Basidiomycota（擔子菌門）和Ascomycota（子囊菌門）[9]。

本研究依托于亞熱帶紅壤丘陵區的長期定位施肥試驗，選擇兩種土地利用方式（旱地和水旱輪作地）下兩種施肥模式（單施化肥與秸稈還田配施化肥）的農田生態系統為研究對象，研究紅壤丘陵區旱地和水旱輪作地土壤中纖維素降解功能微生物群落特征，探索纖維素含量與纖維二糖水解酶、cbhI基因豐度的關系，為揭示農田土壤有機質中易分解組分（纖維素）轉化的微生物機制提供基礎數據。

1 研究地區與研究方法

1.1 樣地描述與試驗布置

長期定位試驗點位于湖南省桃源縣盤塘鎮（29°13′48″N，111°31′48″E），屬中亞熱帶北緣的紅壤丘陵區，為亞熱帶濕潤季風氣候，年均氣溫16.8℃，年均降雨量1230 mm，土壤為黏性土，成土母質為第四紀紅土。

長期定位試驗前，試驗點由杉木為主的森林植被覆蓋。2000年，中國科學院亞熱帶農業生態研究所建立了旱地和水旱輪作地長期定位施肥試驗，兩個試驗點相距約50 m。2013年4月23日，選取兩種土地利用方式下的單施化肥（NPK：以尿素、過磷酸鈣及氯化鉀施用 N、P、K 分別為 224、52、174 kg·hm-2·a-1） 和秸稈還田配施化肥處理（NPKS：在秸稈還田的基礎上，以尿素和過磷酸鈣補充不足的氮和磷）[12]。處理間保持N、P、K總量一致，每種處理4個重復，按隨機區組設計排列。旱地每個小區面積為23.3 m2、水旱輪作地的每個小區面積為22.4 m2，小區間用水泥板隔離（埋入深度≥30 cm）。旱地采用紅薯-油菜輪作、水旱輪作地則為玉米-水稻-綠肥（紫云英）輪作，根據作物需求一年內進行基肥和追肥的施用[13]。

于2013年4月25日在每個小區按“之”字型打入5個PVC管（高35 cm、直徑25 cm、入土深度28 cm），將其中表層土壤（0～15 cm）取出后，與肥料或者秸稈混勻后再回填PVC管內，略壓實。PVC管內肥料或者秸稈的添加量根據PVC管內土壤面積占小區面積的百分比對應施入相應小區施肥量的一半，其中NPKS處理需將玉米秸稈滅菌并剪碎至長度為1 cm左右，配合化肥與土壤混合。施肥后用尼龍網對PVC管進行封口以防試驗過程中外界植物凋落物進入。

1.2 樣品采集與處理

以2000年試驗點本底土壤樣品代表施肥處理前；于2013年4月23日進行樣品采集，代表長期（13年）施肥處理后。隨后打入PVC管，并于施肥處理后第3 d開始進行每3個月一次的周年季節性采樣，采樣時間分別為2013年4月28日、7月28日、10月28日以及2014年1月28日和4月28日。對每個小區進行土樣采集（采樣深度為15 cm，每個PVC管中采集一土鉆）并混合作為一個土樣（約150 g），樣品分為三部分：一部分經自然風干后磨細過篩用于纖維素含量分析，第二部分保存于4℃用于酶活性分析，第三部分保存于-80℃冰箱用于微生物分子生物學分析。經分析，2000年旱地和水旱輪作地試驗點本底土壤中纖維素含量分別為0.98、0.76 g·kg-1干土。

1.3 研究方法

1.3.1 土壤纖維素含量的測定

土壤中纖維素含量采用酸解法測定[14-15]，具體步驟為：

總碳水化合物：取過80目土樣1 g，加入12 mol·L-1硫酸，室溫振蕩 16 h，加水稀釋至 1 mol·L-1，100 ℃冷凝回流5 h，冷卻離心，取1 mL上清液用蒽酮-硫酸法測定還原糖含量。

稀酸水解碳水化合物：取過80目篩的土樣1 g，加入10 mL 0.5 mol·L-1硫酸，采用冷凝回流方式，在80℃下水解24 h，取1 mL水解液用硫酸-蒽酮法測定還原糖量。

纖維素含量=總碳水化合物-稀酸水解碳水化合物。

1.3.2 酶活性的測定

纖維二糖水解酶（CBH）活性采用熒光微孔板檢測法測定[16]，底物為 4-MUB-β-D-cellobioside。土壤多酚氧化酶和過氧化物酶參考李振高等[17]的方法進行測定。

1.3.3 土壤微生物分子生物學分析

1.3.3.1 土壤微生物總DNA提取

將存于-80℃土壤樣品冷凍干燥后進行研磨并分裝，采用FastDNARSpin Kit for Soil試劑盒提取土壤微生物總DNA。

1.3.3.2 熒光定量PCR

采用編碼纖維二糖水解酶的功能基因cbhI的引物Fung cbhIF/Fung cbhIR[6]進行熒光定量PCR擴增，目的基因長度為520 bp。擴增反應條件：94℃2 min；40 個循環為 94 ℃ 30 s，48℃ 45 s，72 ℃ 60 s；1 個循環為 95 ℃ 15 s，60℃ 15 s，95 ℃ 15 s。擴增體系（10 μL）均為：5 μL SYBRPremix Ex Taq II（2×，Takara），上游和下引物各 0.4 μL（10 μmol·L-1），DNA 模板 1 μL（5 ng），ddH2O 補至 10 μL。對目的基因進行熒光定量PCR擴增的同時，以不同濃度梯度的含目的基因質粒DNA模板制作標準曲線。標準曲線的優劣取決于其擴增效率及R2值，擴增效率適用范圍為90%～110%，R2須大于0.99，且標準曲線擴增熔解曲線應是單峰，并可作為DNA樣品熒光定量的參照，以反映其擴增的專一性。每個樣品3次重復，并設置陰性對照，以384孔板作為載體進行PCR擴增，所用儀器為ABI7900。

1.3.3.3 末端限制性片段長度多態性（T-RFLP）分析

T-RFLP是基于不同目的基因片段限制性酶切長度多態性進行微生物種群結構研究的方法，被廣泛應用于微生物群落結構分析。操作步驟如下：首先，以Fung cbhIF/Fung cbhIR為引物對提取的DNA進行PCR擴增，其中Fung cbhIF的5′端用6-FAM進行熒光標記。擴增體系（25 μL）為：2× PCR Premix（0.1U PrimeSTAR HS DNA Polymerase，0.5 mmol·L-1dNTPs，Takara）12.5 μL，上游和下引物各 10 pmol·L-1，DNA模板 1 μL，ddH2O 補至 25 μL。其中 cbh I擴增程序為：94 ℃ 5 min，35 個循環為 94 ℃ 30 s，48 ℃ 45 s，72℃90 s；最后72℃延伸15 min。所有引物由上海英濰捷基貿易有限公司合成，PCR擴增反應采用Eppendorf Mastercycler（Gemany）。隨后對PCR產物進行純化，具體步驟為：將獲得的PCR產物進行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，然后在紫外條件下切取目的條帶并利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（TIANGEN）對其進行凝膠回收純化。參照Fan等[5]的方法，選擇Taq1酶作為cbhI基因的限制性內切酶對純化所得DNA進行酶切，反應條件及體系按說明書設置。將酶切產物送至上海桑尼生物科技有限公司（Sunny Biotechnology Co.，Shanghai）進行T-RFLP（末端限制性片段長度多樣性）檢測。

將檢測所得T-RFLP圖譜中相差1 bp以內的TRFLPs（限制性酶切片段）作為同一個操作分類單元（OTU，operational taxonomic unit），OTU 豐度用相對峰值表示，并去除OTU豐度百分比小于1%或長度小于50 bp 的 T-RFLPs。

1.3.3.4 克隆文庫的構建

以Fung cbhIF/Fung cbhIR為引物的PCR擴增產物（四個重復等體積混合）經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，采用Wizard SV Gel and PCR Clean-UP System試劑盒（Promega）回收目的片段；運用PGEM-T載體試劑盒（Promega）對回收的cbhI基因目的片段（520 bp）進行克??；挑取白色菌落用載體特異性引物Sp6和T7對克隆產物進行菌液PCR擴增，經電泳后每個樣品篩選120個有預期片段的克隆子進行測序（華大基因），測序儀為ABI Prism 3100 Genetic Analyzer。獲得的有效序列與GenBank數據庫中已有序列進行比對，選取最高同源序列確定序列的微生物分類。本研究所獲得的cbhI基因代表序列已提交GenBank數據庫，序列登錄號為MF188259～MF188843。

1.4 數據分析方法

運用SPSS 20.0軟件對本研究同一時間點各處理的纖維素含量、纖維二糖水解酶活性、cbhI基因豐度進行方差分析，相關圖采用Excel 2013繪制。采用Sigmaplot 12.5軟件對兩種土地利用方式下纖維素含量與纖維二糖水解酶活性、cbhI基因豐度與纖維二糖水解酶活性之間的關系進行回歸分析并繪圖。TRFLP數據采用Primer 5.0進行群落相似性分析。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解動態特征

經連續13年定位施肥后，旱地土壤中纖維素含量略微上升（差異不顯著），而水旱輪作地則略微下降，且均為NPKS處理顯著高于NPK處理（p＜0.05）。就周年季節變化來看，施用NPKS后旱地和水旱輪作地纖維素含量分別由 1.09、0.75 g·kg-1增至 2.44、1.98 g·kg-1。3個月后，旱地和水旱輪作地土壤中纖維素新增含量的56%和100%被降解或被轉化為其他形態；至6個月后，兩種土地利用方式下農田土壤中纖維素含量均已降解到施肥前水平。施用NPK后，農田土壤中纖維素含量的周年季節變化幅度不大（圖1）。

圖1 不同處理下土壤中纖維素含量的周年動態變化Figure 1 Dynamic of cellulose content in treated soils

2.2 纖維二糖水解酶酶活性與纖維素含量變化的關系

降解纖維素的功能酶纖維二糖水解酶活性為旱地＞水旱輪作地（p＜0.01），同一土地利用方式下均以NPKS處理顯著高于NPK處理（p＜0.05或p＜0.01，圖 2）。

圖2 不同處理下土壤中纖維二糖水解酶活性動態變化Figure 2 Dynamic of cellobiohydrolase activity in treated soils

兩種土地利用方式下纖維素含量與纖維二糖水解酶活性的動態變化回歸分析結果表明，旱地和水旱輪作地中的纖維素含量與纖維二糖水解酶活性均呈線性正相關，其線性回歸方程分別為y=10.65x+11.05（R2=0.34p＜0.01）和 y=2.77x+5.79（R2=0.47，p＜0.01）（圖 3）。

2.3 農田土壤中纖維素降解功能基因（cbhI）豐度

2013年4月進行施肥處理前，旱地土壤中纖維素降解功能基因（cbhI）豐度略高于水旱輪作地（圖4）。秸稈還田配施化肥（NPKS）后cbhI豐度急劇上升（p＜0.05），其中水旱輪作地增幅最大，達到了施肥前4.4倍，旱地和水旱輪作地中cbhI豐度分別在施肥處理6個月和3個月后降至施肥前水平，與纖維素含量變化基本一致（圖1和圖4）。NPK處理后，cbhI基因豐度也出現一定程度的增長，之后隨季節小幅波動，整個周年均以旱地高于水旱輪作地（圖4）。

圖3 旱地和水旱輪作地中纖維素含量與纖維二糖水解酶活性的線性關系Figure 3 Linear relationship between cellulose content and cellobiohydrolase activity in upland and upland-paddy rotation land soils

圖4 纖維素降解功能微生物群落豐度周年動態變化Figure 4 Annual dynamic of the cellobiohydrolases genes abundance

將兩種土地利用方式下纖維二糖水解酶活性與cbhI基因豐度的動態變化作回歸分析，其結果表明，旱地和水旱輪作地中的纖維二糖水解酶活性與cbhI基因豐度均呈線性正相關，其線性回歸方程y=4.22+0.12x（R2=0.20，p＜0.01）和 y=-0.63+0.89x（R2=0.47，p＜0.05）（圖 5）。

2.4 農田土壤中含cbhI基因功能真菌群落特征

基于T-RFLP測序數據，對施用NPK和NPKS后兩種土地利用方式的纖維素降解功能微生物（含cbhI真菌）群落相似性進行聚類分析，結果表明：旱地和水旱輪作地分別聚為一簇；旱地的NPK和NPKS分別聚集在一起；在2013年和2014年的4月，水旱輪作地的NPK和NPKS處理群落相聚較近，而其他季節NPK和NPKS均相互交叉聚集（圖6）。

圖5 旱地和水旱輪作地中纖維二糖水解酶活性與cbhI基因豐度的線性關系Figure 5 Linear relationship between cellobiohydrolase activity and cbhI gene abundance in upland and upland-paddy rotation land soils

圖6 纖維素降解微生物（含cbhI基因的真菌）群落相似性Figure 6 Similarity of fungal community containing cbhI gene in the treated soils

經克隆測序，本研究農田土壤中含cbhI基因功能微生物主要屬于擔子菌門和子囊菌門，可分為五綱，分別為傘菌綱（擔子菌門）和錘舌菌綱、糞殼菌綱、座囊菌綱及散囊菌綱（子囊菌門），其中傘菌和糞殼菌分別占總克隆庫的22.9%～39.5%（平均為34.7%）、17.7%～42.3%（平均為28.5%），為優勢類群（圖7）。此外，12.0%～29.8%的序列屬于未知微生物。

圖7 纖維素降解功能微生物群落結構周年動態變化Figure 7 Annual dynamic of the microbial communities related to cellulose decomposition

NPK施肥前和施肥后一年內，旱地和水旱輪作地土壤中纖維素降解微生物群落保持基本穩定。與NPK處理相比，NPKS處理下旱地和水旱輪作地傘菌總體比例分別由36.4%、37.8%降低至34.2%、30.6%，而糞殼菌分別由23.0%、24.6%增加至34.7%、31.5%（圖7）。與施肥處理前（2013年4月23日）相比，NPKS施肥后一年內旱地和水旱輪作地中纖維素降解優勢菌傘菌比例呈先降低后增加的趨勢，而糞殼菌則表現為先增加后降低。非優勢菌散囊菌與糞殼菌有相似的趨勢。

3 討論

3.1 農田土壤中纖維素的降解特征

長期（13年）秸稈還田后，旱地和水旱輪作地中纖維素含量未發生大量積累（旱地增加13%、水旱輪作地減少6%），說明農田土壤中纖維素不能以原始纖維素狀態進行積累。本研究未采用同位素標記技術對纖維素去向進行追蹤，因此纖維素有可能轉化為其他形態（微生物生物量、可溶性有機質、腐殖質等）進行積累。周年季節變化來看，秸稈還田后旱地和水旱輪作地中纖維素在3個月和6個月即降至還田前水平。這表明，秸稈還田后土壤中纖維素會發生一段時間的快速降解，進而降解趨于緩滯、保持相對穩定狀態。纖維素的這種動態過程與纖維素的存在形式密切相關：單獨存在的纖維素分子在土壤中會被快速酶解，而一些包埋于木質素外殼中的纖維素分子降解則相當困難，使土壤中纖維素表現出先快后慢的降解特征[18]。水旱輪作地比旱地土壤中纖維素降解更快，其原因一方面可能是由于水分條件改變引起的土壤團聚體受損、黏土膠溶破壞了土壤結構[19]，使水旱輪作地中纖維素分子穩定性可能不如旱地，從而更容易被降解；另一方面，水旱輪作地厭氧和好氧微生物更替過程中細胞溶解會釋放出大量的氮和磷，顯著提高了土壤活性微生物含量，加速了土壤微生物的代謝過程[20]。秸稈還田后（圖2），水旱輪作地中纖維二糖水解酶活性上升了51.9%，顯著高于旱地土壤（增幅僅為8.2%），進一步證實水旱輪作地比旱地中纖維素降解潛力更大。

3.2 農田土壤中纖維素降解關鍵微生物及其豐度特征

纖維素降解過程主要由微生物實現，而參與纖維素降解的微生物類群眾多。因此，明確能指示纖維素降解的微生物功能基因是研究土壤中參與纖維素降解的微生物功能群首要前提。本研究中兩種土地利用方式下纖維素含量與纖維二糖水解酶活性呈顯著正相關，而編碼纖維二糖水解酶的真菌cbhI基因豐度與纖維二糖水解酶均呈現正相關（表2和表3），表明真菌cbhI基因可較好地用于表征本研究供試土壤中參與纖維素降解/轉化過程微生物功能群。需指出的是，該結果并不能說明供試農田土壤中纖維素的降解由真菌主導或者真菌比細菌貢獻大。真菌和細菌群落對纖維素降解的貢獻大小可通過下一步抑真菌/細菌實驗予以驗證[21]。

秸稈還田后土壤中cbhI基因豐度均顯著增長，旱地和水旱輪作地中cbhI基因豐度則分別在施肥處理6和3個月后降至施肥前水平，與纖維素含量變化趨勢一致（圖1和圖2）。這說明功能微生物數量的動態變化依賴于底物（纖維素）的豐缺。此外，秸稈中含有包括纖維素在內的多種有機物質，特別是一些小分子碳水化合物能極快地被糖苷酶降解產生葡萄糖，為微生物的繁殖提供能量保障，并通過釋放纖維素酶進而降解纖維素[22-23]。另一方面，化肥（NPK）的輸入也會激發纖維素降解功能菌的生長繁殖，增強土壤纖維素酶活性[24]。

3.3 農田土壤中纖維素降解關鍵微生物群落特征

本研究中，旱地和水旱輪作地的纖維素降解微生物（含cbhI基因）互相分離，兩者的群落組成相似性小于60%（圖6），表明與施肥相比，土地利用方式是引起農田土壤中纖維素降解群落組成改變最主要的因素。水旱輪作地由于淹水-落干的反復交替，其土壤物理、化學環境頻繁變動，造成微生物群落更替頻繁，而旱地土壤環境相對穩定[25，20]。兩種施肥方式下，旱地土壤中功能真菌群落能夠較好地分開，說明施肥對環境相對穩定的旱地土壤微生物群落影響較大；水旱輪作地除了在2013年和2014年的4月（距施肥的時間較遠）外，其余時期NPK和NPKS處理交叉聚集，說明水旱輪作的淹水-落干的反復交替過程弱化了施肥對土壤微生物群落的影響。

目前，對于土壤生態系統中纖維素降解微生物群落的研究較少。Fontaine等[22]發現向不同土層土壤中添加纖維素后，微生物數量均顯著上升，纖維素開始迅速降解。黃淮海平原典型潮土中含cbhI基因的纖維素降解微生物群主要屬于擔子菌門和子囊菌門，且存在大量不可培養纖維素降解菌[9]。Fan等[5]研究表明，長期施肥下黑土玉米地土壤中未檢測到含cel5基因的細菌，其纖維素降解功能微生物（含cbhI基因）中傘菌、座囊菌、散囊菌、糞殼菌和未知菌比例分別為16.4%、19.7%、36.8%、15.1%、10.5%，且其纖維素的降解能力（纖維二糖水解酶活性）主要由含cbhI基因的真菌群落結構及多樣性決定。與上述黑土和潮土研究一致，紅壤丘陵區農田土壤中纖維素降解菌也主要屬于擔子菌門和子囊菌門，但優勢類群差異明顯（圖7）。本研究紅壤丘陵區旱地和水旱輪作地不同施肥處理下土壤中纖維素降解菌（含cbhI基因）均以傘菌和糞殼菌占絕對優勢，而在黑土和潮土中占絕對優勢的散囊菌在本研究土壤中僅占各克隆庫的2.9%～10.3%（平均為5.8%），可能是土壤類型不同帶來的基本物理化學性質差異以及不同氣候帶引起多方面環境條件不同造成的。兩種土地利用方式下，與施化肥相比，秸稈還田（NPKS處理）后6個月內，糞殼菌和散囊菌占克隆庫比例增加（尤其是3個月內急劇增加），6個月以后其比例逐漸降低，與纖維素降解趨勢剛好吻合（圖1和圖7）?；诩S殼菌（綱）為供試土壤中的優勢纖維素降解功能菌（平均占NPKS處理克隆庫總克隆子的33.1%），并且廣泛存在于紅壤丘陵區農田土壤中[26]，我們推測本研究紅壤丘陵區旱地和水旱輪作地土壤中纖維素降解過程可能主要由糞殼菌主導。但是，由于本研究獲得的絕大部分糞殼菌（綱）與Gen-Bank中已知分類的微生物序列相似性小于95%，無法獲知其“屬”、“種”分類信息，其在纖維素降解過程中的具體功能與機制有待后續深入研究。

4 結論

（1）長期施肥后，旱地和水旱輪作地中纖維素含量未大量積累，且秸稈還田后3至6個月纖維素即被降解或轉化為其他形態，降解速率以水旱輪作地快于旱地。

（2）纖維二糖水解酶活性與纖維素含量呈顯著正相關，而真菌cbhI基因豐度與纖維二糖水解酶呈線性正相關（p＜0.01或p＜0.05），功能基因 cbhI可用于指示本研究旱地和水旱輪作地土壤中降解纖維素的關鍵微生物群。

（3）聚類分析表明，旱地和水旱輪作地的纖維素降解微生物（含cbhI基因）互相分離，即：與施肥相比，土地利用方式是引起土壤中纖維素降解群落組成改變最主要的因素。

（4）紅壤丘陵區的兩種土地利用方式下纖維素降解功能微生物以傘菌和糞殼菌占絕對優勢，其中秸稈還田后的纖維素降解過程可能由糞殼菌主導。

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Characteristics of cellulose-degrading microbial communities in upland and paddy-upland rotation land soils in red soil hilly region

WANG Yu-qing1,2,CHEN Xiang-bi2*,DONG Ming-zhe2,FENG Shu-zhen2,3,HU Ya-jun2,SU Yi-rong2,GE Ti-da2,ZHANG Zhen-hua4,LI Qiao-yun1*
（1.College of Biological Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2.The Key Laboratory of Subtropical Agro-Ecology,Institute of Subtropical Agriculture,The Chinese Academy of Sciences,Changsha 410125,China;3.Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545006,China;4.Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops in China,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China）

Cellulose is the most abundant organic component in crop residue and thus plays a vital role in organic matter transformation in a-gricultural soils.The degradation of cellulose in soil is mainly driven by microorganisms.The fungal cbhI gene is one of the key microbial genes participating in cellulose degradation.Based on long-term field experiments in subtropical hilly region,two land use types（upland and paddy-upland rotation land）and two fertilization treatments（chemical fertilizers and chemical fertilizers combined with crop straw）were selected for this study.The annual dynamics of cellulose content,cellobiohydrolase activity,and abundance and composition of cellulose-degrading microbial communities containing cbhI in surface soils were analyzed to reveal the characteristics of microbial decomposition of cellulose in agricultural soils.Results showed that after 13 years of long-term fertilization,cellulose had not accumulated significantly.Annual dynamic data indicated the newly added cellulose was degraded or converted into other forms within 6 and 3 months after straw incorporation into upland and paddy-upland rotation land soils,respectively.Both the Pearson correlation analysis and stepwise linear regression analysis showed that cellulose contents were positively related to the activity of cellobiohydrolase and that abundances of the fungal cbhI gene were positively related to cellobiohydrolase activity（p＜0.01）.This indicated that the fungal cbhI gene may be a potentially corresponding indicator of microbial decomposition of cellulose in the tested agricultural soils.Cluster analysis showed that cellulose-degrading microbial communities in upland soils and paddy-upland rotation land soils were separated from each other,suggesting that land-use type is the key factor in shaping cellulose-degrading microbial communities as compared with the fertilization treatments.Cloning and sequencing data showed that Agaricomycetes and Sordariomycetes,which accounted for 22.9%～39.5%（average 34.7%）and 17.7%～42.3%（average 28.5%）of total clones,respectively,were the dominant cellulolytic microbial groups.Sordariomycetes may dominate the microbial process of cellulose decomposition after crop straw returns to the field.This study clarified the similarities and differences of cellulose decomposition and its functional microbial communities between upland and paddy-upland rotation land after straw returns to the field,and thus provided the basic data on revealing microbial mechanisms of labile soil organic matter（cellulose）turnover in agricultural soils.

cellulose;upland;upland-paddy rotation land;cellobiohydrolase;microbial community

S154.3

A

1672-2043（2017）10-2071-09

10.11654/jaes.2017-0493

王雨晴，陳香碧，董明哲，等.紅壤丘陵區旱地和水旱輪作地土壤中纖維素降解功能微生物群落特征[J].農業環境科學學報,2017,36（10）：2071-2079.

WANG Yu-qing,CHEN Xiang-bi,DONG Ming-zhe,et al.Characteristics of cellulose-degrading microbial communities in upland and paddy-upland rotation land soils in red soil hilly region[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（10）：2071-2079.

2017-04-05 錄用日期：2017-07-06

王雨晴（1993—），女，湖南岳陽人，碩士研究生，主要從事農田土壤碳氮微生物轉化研究。E-mail：Alex0517@163.com

*通信作者：李巧云 E-mail：1065596897@qq.com；陳香碧 E-mail：xbchen@isa.ac.cn

國家重點研發計劃項目（2016YFD0200106-5）；國家自然科學基金項目（41671298，41301273）；“西部之光”人才培養計劃

Project supported：National Key Research and Development Program（2016YFD0200106-5）；The National Natural Science Foundation of China（41671298，41301273）；The Western Light Project from CAS to Xiangbi Chen