旱柳在Pb、Cd脅迫下實時熒光定量PCR內參基因的篩選

曾 璟 ，王 平 ，孫吉康 ，楊嵐鵬 ，周 韜 ，榮 健

（中南林業科技大學 a.生命科學與技術學院；b.環境科學與工程學院， 湖南 長沙 410004）

旱柳在Pb、Cd脅迫下實時熒光定量PCR內參基因的篩選

曾 璟a，王 平b，孫吉康a，楊嵐鵬b，周 韜a，榮 健a

（中南林業科技大學 a.生命科學與技術學院；b.環境科學與工程學院， 湖南 長沙 410004）

為篩選適用于Pb與Cd脅迫下旱柳實時熒光定量PCR的內參基因，應用熒光定量PCR技術分析UBQ1、TUB6、Actin、EF1α、18SRNA、GAPDH、TUA8和UBQ2這8個內參基因在旱柳根部的表達情況。通過Norm finder、geNorm和Best Keeper3個軟件進行綜合分析，發現在Pb與Cd脅迫下表達較為穩定的內參基因均為EF1α、GAPDH和Actin，差別是在Pb脅迫下的旱柳根組織中最為穩定的內參基因是EF1α，而在Cd脅迫下的旱柳根組織應最穩定的內參基因為GAPDH。該研究結果可用于旱柳根組織在Pb、Cd脅迫下基因表達的進一步研究。

鉛；鎘；實時熒光定量PCR；內參基因

常用檢測基因表達水平的方法有4種，分別是實時定量PCR(quantitative real-time polymerase chain, qRT- PCR)、原位雜交(in situ hybridization,ISH)、Northern印 跡 (northern blot)和 DNA 微陣列(DNA microarray)[1]。qRT-PCR是最為常用的一種，其具有定量快速準確、重復性好、高靈敏度和特異性強的特點[2]，已被廣泛應用于微生物學、生物科學、分子醫學以及診斷學等領域。qRT-PCR對所提取RNA的品質、模板cDNA的濃度和質量、引物的特異性、擴增效率以及內參基因的選擇等有著嚴格的要求[3]，因此篩選表達穩定的內參基因是qRT-PCR至關重要的一部分。內參基因也被稱作管家基因或看家基因，內參基因的作用是為了消除在運用qRT-PCR方法計算基因相對表達量時，由于RNA質量、不同效率的酶促反應以及其他因素引起的偏差[4]。目前在植物學研究中，常用穩定表達的內參基因有18S核糖體RNA（18SrRNA）、微管蛋白基因（Tubulin）、多素泛聚酶基因（UBQ）、肌動蛋白基因（Actin）、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶基因（GAPDH）以及延伸因子基因（EF1-α）等[5]。內參基因的穩定性在不同植物組織部位、生長環境等因素下都會產生不同程度的表達差異[6]，因此根據不同的材料，不同的實驗設計選擇合適的內參基因在qRT-PCR中就很有必要。

旱柳（Salix matsudanakoids）作為一種對多種重金屬有較強耐受性的木本能源植物，在修復土壤重金屬污染方面有著巨大的潛力[7-11]。針對旱柳的這一特性，Yang等[12]運用分子生物學手段研究了Cd脅迫下旱柳根與葉的轉錄組和生理響應機制，同時還發現旱柳轉錄組和生理對Cd脅迫的響應表現出組織特異性。楊衛東等[13]系統地研究了旱柳對Cd的積累、忍耐與解毒生理機制，以及Cd脅迫對旱柳幼苗的生長、低分子量巰基化合物含量、抗壞血酸－谷胱甘肽循環、谷胱甘肽代謝的影響。朱健等[14]研究旱柳對Pb的耐性和富集、轉運特征，分析了旱柳根、莖、葉的生理生化、微觀結構、官能團組成、礦質元素吸收對不同含量Pb脅迫的響應。由于旱柳在重金屬脅迫下的內參基因篩選尚無報導，為了研究Pb、Cd脅迫下旱柳根部主要的3種抗性酶的基因表達量，本文針對Pb、Cd脅迫下旱柳根部的內參基因篩選進行研究，為今后旱柳在Pb、Cd脅迫下的分子研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料和處理方法

本實驗使用的旱柳取自浙江旱柳養殖基地1年生幼苗。將長勢一致的旱柳枝條修剪為15 cm長，放入燒杯中進行水培，水培基質為1 L純水加入3滴濃縮培養液組成，水培14 d待扦插的旱柳根部生長至一定程度之后進行梯度實驗（見表1）。實驗設計2種重金屬離子脅迫處理，分別為Cd與Pb，每種重金屬脅迫設置4組梯度3組平行實驗，然后將根部生長較好的旱柳水培苗以每十枝一組分別放入不同重金屬離子濃度梯度的燒杯中培養，培養14 d后取根系用液氮速凍后放入-80 ℃冰箱保存，供下一步分析。

表1 實驗設計的樣品濃度梯度Table 1 Experimental design of the sample concentration gradient

1.2 RNA提取和cDNA合成

利 用TIAN GEN RNA prep Pure Plant Kit（Polysaccharides & Polyphenolics rich）RNA prep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取旱柳根部總RNA，并用DNase I (RNase free)消化去除DNA污染。用瓊脂糖電泳檢測總RNA提取質量并拍照。然后利用反轉錄試劑盒PrimeScript TM RTreagent Kit with g DNA Eraser將RNA逆轉錄為cDNA，將獲得的產物放入-20 ℃保存備用。

1.3 內參基因的篩選與引物設計

選擇8個常用的內參基因作為候選基因，這8個基因分別是ACT(肌動蛋白基因)、TUA8(α微管蛋白基因)、TUB6(β微管蛋白基因)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸-脫氫酶基因)、18SrRNA(18S 核糖體RNA基因)、EF1α（轉錄延伸因子）、UBQ2(泛素基因)、UBQ1(泛素基因)。通過同源基因序列比對之后，利用軟件primer5.0進行引物設計。

1.4 內參基因的普通PCR

反應體系為 20 μL，其中包括 0.5 μL 10 μmol·L-1上游引物、0.5 μL 10 μmol·L-1下游引物，1 μL cDNA 模 板，10.5 μLPCRmix 和 7.5 μL dd H2O。反應條件為94 ℃預變性1 min；98 ℃變性15 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，35 個循環；72 ℃延伸5 min。最后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

1.5 內參基因qRT-PCR擴增程序

采用CFX96 Real-Time PCR Detection System進行各內參基因的qRT-PCR分析。反應體系10 μL，包括SYBR Green Fast q PCR Master Mix (BBI)5 μL、0.2 μLROX Reference Dye Ⅱ (10 μmol/L)、1 μL 10 μmol·L-1上游引物、1 μL 10 μmol·L-1下游引物、2 μL cDNA 2 μL 和 0.8 μL dd H2O。每個樣品重復3次，并設置不加模板的陰性對照。反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，57 ℃退火34 s。采集溶解曲線熒光信號。實驗數據采用相對定量法分析。

1.6 內參基因的擴增效率與線性考察

隨機選取Pb脅迫下的旱柳的第一鏈cDNA樣品，用dd H2O依次稀釋5個梯度，稀釋梯度為起始模板濃度的1、1/2、1/4、1/8和1/16。每個反應設3個技術重復，按1.5的反應體系和程序進行分析。

1.7 數據分析

實驗共用3種軟件geNorm、Bestkeeper和Norm Finder，分析8個常用的內參基因在不同濃度的Pb與Cd脅迫下的表達穩定性。

程序根據8個常用內參基因在不同濃度的Pb與Cd脅迫下對8個內參基因的表達穩定性進行分析，篩選合適的內參基因。根據公式Q=EΔCt利用Excel 2010對各個擴增樣品的Ct值計算8個內參基因的相對表達量。其中E為基因擴增效率，ΔCt=Ct(min)?Ct(樣品 )，Ct(min)為所有樣品中最低的Ct值，Ct(樣品)為每個樣品的Ct值[15]。

2 結果分析

2.1 RNA樣品品質的檢測

各總RNA樣品在濃度適宜的情況下OD值在A260/A280以及A260/A230均為1.8左右，均可滿足轉錄實驗的要求，各總RNA樣品均呈現28 S和18 S共2條清晰的條帶（見圖1），并且28 S條帶亮度較為明亮大約為18 S條帶的2倍，說明RNA完整性良好，符合后續實驗要求[16]。

圖1 旱柳根組織部位總RNA的電泳結果Fig. 1 Electrophoresis results of total RNA extracted from roots of Salix matsudana

2.2 內參基因的普通PCR擴增

經1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示，各內參基因的普通PCR結果均可見預期大小的PCR產物，在100～250 bp之間存在較亮的特異條帶，且條帶單一，沒有引物二聚體及非特異性條帶，表明引物設計成功，可用于后續qRT-PCR分析（見圖2）。

2.3 內參基因的線性分析

圖2 8種內參基因的PCR擴增產物Fig.2 PCR products of eight reference genes

將cDNA模板以2倍梯度稀釋，對8個內參基因作標準曲線分析，結果為線性關系很好，各內參基因的標準曲線相關系數為R2≥0.990。并且，擴增效率E均在100%以上（見表2），各3組技術重復的樣品間的重復性良好，熔解曲線均只產生單一的熔解峰，不存在引物二聚體等非特異擴增。表明各內參基因的線和性擴增效率均符合要求。

2.4 內參基因Ct值分析

通過qRT-PCR分析可以得到8個內參基因在Pb和Cd不同濃度脅迫下旱柳根部的Ct值。由基因表達量與Ct值呈反比，可得知在Pb與Cd脅迫下表達量最高的都是18SRNA。并且可以觀察到不同濃度的Cd脅迫對內參基因表達量的影響更加明顯（見圖3）。

2.5 內參基因的篩選

2.5.1 geNorm 分析

geNorm V3.5是根據平均表達穩定指數M判斷內參基因的穩定性，M值越大則表示內參基因越不穩定，反之則越穩定[17]。M=1.5為判定上線，只有M＜1.5才認為內參基因表達穩定。geNorm分析結果表明，8個內參基因的M值均＜1.5，說明這8個內參基因都比較穩定，而在Pb脅迫條件下EF1α與GAPDH的M值最小，說明在此條件下這兩個內參基因表達最為穩定，8個內參基因穩定性排序為EF1α＝GAPDH＞18SRNA＞Actin＞UBQ2＞TUB6＞TUA8＞UBQ1；在Cd脅迫條件下Actin與GAPDH的M值最小，說明在此條件下這兩個基因表達最為穩定8個內參基因穩定性排序為GAPDH＝Actin＞EF1α＞TUB6＞UBQ2＞TUA8＞UBQ1＞18SRNA（見圖4）。

2.5.2 BestKeeper 分析

BestKeeper分析標準變異系數和變異相關系數來判斷其表達穩定性，運用Ct值計算標準偏差SD來進行分析內，SD值越小，基因的穩定性越好。若SD＞1，則認為該基因不穩定[18]。有結果分析可以的到在Pb脅迫下表達最為穩定的內參基因為UBQ2其次是GAPDH，8個內參基因穩定性排序為UBQ2＞GAPDH＞TUB6＞EF1α＞18SRNA＞Actin＞UBQ1＞TUA8；在Cd脅迫下表達最為穩定的內參基因為TUB6其次是18SRNA，8個內參基因穩定性排序為TUB6＞18SRNA＞Actin＞EF1α＞GAPDH＞UBQ2＞TUA8＞UBQ1（見表3與表4）。

表2 qRT-PCR檢測中所用的8個看家基因的引物序列及在Pb、Cd脅迫下的PCR擴增效率Table 2 Primer sequences and PCR efficiency of eight reference gene under stress of Pb and Cd for q RT-PCR analysis

圖3 在Pb、Cd脅迫下8個內參基因旱柳根組織中的表達情況（左圖為Pb脅迫，右圖為Cd脅迫）Fig. 3 Expression levels of eight reference genes in roots under Pb and Cd stress of Salix matsudana

圖4 Pb、Cd脅迫下8個看家基因的表達穩定性的geNorm分析（左圖為Pb脅迫，右圖為Cd脅迫）Fig. 4 Expression stability of eight reference genes analyzed under Pb and Cd stress by geNorm

表3 用Best Keeper軟件分析Pb脅迫下內參基因的表達穩定性Table 3 Expression stability of reference genes analyzed under stress of Pb by Best Keeper

表4 用Best Keeper軟件分析Cd脅迫下內參基因的表達穩定性Table 4 Expression stability of reference genes analyzed under stress of Cd by Best Keeper

2.5.3 Norm Finder 分析

Norm Finder程序是運用Excel進行計算方差，根據方差分析得到M值，根據M值評價內參基因的穩定性，M值越大則表示內參基因越不穩定，反之則越穩定[19]。經過計算的出8個內參基因不同脅迫條件下的M值，Pb脅迫下EF1α的M值最小，穩定性最佳，其次是Actin穩定性為第二，8個內參基因穩定性排序為EF1α＞Actin＞GAPDH＞18SRNA＞TUB6＞UBQ2＞TUA8＞UBQ1；Cd脅迫下GAPDH穩定性最佳，其次是EF1α，8個內參基因穩定性排序為GAPDH＞EF1α＞TUB6＞Actin＞UBQ2＞TUA8＞UBQ1＞18SRNA（見圖5）。

圖5 Pb、Cd脅迫下8個看家基因的表達穩定性的 Norm Finder 分析（左圖為Pb脅迫，右圖為Cd脅迫）Fig. 5 Expression stability of eight reference genes analyzed under Pb and Cd stress by Norm Finder

綜上所述，根據3種軟件geNorm、Bestkeeper和Norm Finder分析結果可知，在Pb和Cd脅迫下旱柳根部的8個內參基因的表達穩定性略有差異，Pb脅迫下表達最為穩的內參基因為EF1α，而Cd脅迫下表達最為穩定的內參基因為GAPDH（見表5），因此EF1α與GAPDH可作為旱柳在Pb與Cd脅迫下基因研究的內參基因。

3 討 論

本實驗基于 Genorm、Bestkeeper和NormFinder軟件分別分析比較了在Pb與Cd脅迫下UBQ1、TUB6、Actin、EF1α、18SRNA、GAPDH、TUA8和UBQ2等8個內參基因在旱柳根部的表達情況。這3個軟件由于算法不相同所以分析得出的結果也不相同，這種情況也經常出現在其他的研究中[20-21]，綜合分析可以得出本研究中Pb與Cd脅迫下表達較為穩定的內參基因均為EF1α、GAPDH和Actin，只是在這兩種重金屬離子脅迫下表達穩定的程度不一致，而最不穩定的內參基因都為UBQ1。EF1α是一種多功能蛋白，其參與多種重要的細胞學過程例如：癌基因轉化、病毒復制、細胞骨架組成、信號轉導、翻譯控制及凋亡等[22]。在Jain等的研究過程中發現，在水稻Oryza sativa不同的組織和發育期表達比較穩定的內參基因為EF1α[23]。當楊樹組織處在干旱脅迫下，EF1α基因的表達也很穩定[24]；GAPDH是糖酵解反應中的一個不可缺少的酶類，在大部分組織中都高水平表達并且在同種組織或者細胞中的蛋白質表達量一般恒定，在部分研究中，例如在毛果楊和煙草組織中GAPDH相對不穩定不適合做為內參基因[25-26]，但在甘蔗Saccharum of ficinarum的不同組織器官中表達最為穩定的為GAPDH[27]，并且在本研究的Pb與Cd脅迫下其表現也非常穩定。Actin基因編碼的肌動蛋白普遍存在于真核生物中，是一種重要的蛋白質，參加多種重要的生理活動，幾乎在所有的真核細胞中具有較為穩定的表達[28]。內參基因應該是不受環境、非生物及生物脅迫等影響且在生物體不同組織、不同細胞中均穩定表達的一類基因，但是實際情況下內參基因的穩定性是相對的。所以應該根據不同的實驗對象，不同的實驗環境來篩選出合適的內參基因[29]。因此本實驗篩選的2個相對穩定的內參基因，僅適用于在Pb與Cd脅迫下旱柳根部組織中基因表達水平的研究，其他組織或脅迫條件有待進一步完善。

表5 在Pb、Cd脅迫下內參基因穩定性Table 5 Stability ranking of candidate reference genes under stress of Pb and Cd

4 結 論

本實驗經Genorm、Bestkeeper和NormFinder軟件分析得出，內參基因EF1α、GAPDH和Actin在Pb與Cd脅迫下表達均較為穩定，在Pb脅迫下最為穩定的內參基因為EF1α，而在Cd脅迫下應最穩定的內參基因為GAPDH。本實驗為后續進行的Pb與Cd對旱柳根部組織中主要抗性酶的基因表達的影響提供基礎資料，同時也為其他重金屬脅迫下內參基因的篩選提供參考。

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Selection of reference genes for quantitative real-time PCR inSalix matsudanaunder stress of Pb and Cd

ZENG Jinga, WANG Pingb, SUN Jikanga, YANG Lanpengb, ZHOU Taoa, RONG Jiana
(a. College of Life Science and Technology; b. College of Environmental Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

In order to screen the internal reference gene ofSalix matsudanaunder the stress of Pb and Cd, the quantitative analysis ofUBQ1,TUB6,Actin,EF1α,18SRNA,GAPDH,TUA8andUBQ2genes in the roots ofSalix matsudanawere studied by fluorescence quantitative reaction Expression. The results showed that the stability ofEF1α,GAPDHandActinwere better, but the degree of expression stability is not consistent under stress of Pb and Cd, through the combination of Normfinder, geNorm and Best Keeper.Therefore, the most stable reference geneEF1αshould be selected under Pb stress, And the most stable internal reference geneGAPDHshould be selected under Cd stress.The results of this study can be used for the further study ofSalix matsudanathe roots of gene expression under Pb and Cd stress.

lead; cadmium; quantitative real-time PCR; reference gene

S792.12；X53

A

1673-923X(2017)08-0086-07

10.14067/j.cnki.1673-923x.2017.08.015

2016-12-12

湖南省重點研發計劃項目“微生物-植物協同修復土壤重金屬污染及配套支撐技術”（2016SK2030）

曾 璟，碩士研究生

王 平，教授； E-mail：wangping@csuft.edu.cn

曾 璟，王 平，孫吉康,等. 旱柳在Pb、Cd脅迫下實時熒光定量PCR內參基因的篩選[J].中南林業科技大學學報，2017,37(8): 86-92.

[本文編校：文鳳鳴]