共培養的水分狀態對農桿菌轉化玉米的影響

呂孟雨 董福雙 張俊敏 王海波

摘 要：農桿菌與受體的共培養條件，對農桿菌介導的遺傳轉化有著重要的作用，為了提高玉米芽生長點的遺傳轉化效率，以鄭58玉米自交系的種子為試驗材料，用EGFP（增強型綠色熒光蛋白）基因作為標記基因，通過控制農桿菌共培養時的水分提供方式，研究共培養時的水分條件對農桿菌轉化玉米芽生長點的影響。結果表明，將轉化的玉米種子放到加有2層濾紙的培養皿中，每培養皿放置10～15粒種子，加1.5 mL無菌水，放在25 ℃暗培養3～4 d，在不影響轉化效果的基礎上有利于轉化后發芽，可獲得較多的轉化材料。

關鍵詞：玉米；農桿菌轉化；共培養；水分

中圖分類號：S513 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.12.003

Abstract： The co-culture condition of agrobacterium and its receptor plays an important role in the agrobacterium-mediaed genetic transformation. The purpose of this study is to improve the genetic transformation efficiency of maize bud growth point. Using the seed of maize inbred line Zheng 58 as the experimental material， EGFP （enhanced green fluorescent protein） gene as reporter， and by controlling the water supply in agrobacterium co-culture， the effect of water condition on the growth point of maize germinating was studied. The results showed that when the transformed maize seeds was cultured in petri dishes with 2 layers of filter papers and 10～15 seeds and 1.5 mL sterile water for 3～4 d at 25 ℃ in dark， it was beneficial to germinate after transformation without affecting the transformation effect， and took more transformants.

Key words： maize； agrobacterium-mediated transformation； co-culture； moisture

玉米是全球分布最廣的糧食作物，是世界重要的三大糧食作物之一，也是中國最重要的作物之一[1-2]。轉基因玉米作為生物技術產業化的重大成果，已在世界各地普遍應用，轉基因玉米在我國的產業化應用也將是大勢所趨，應在技術上和管理上及早準備[3]。研究玉米的遺傳轉化技術具有重要意義，玉米遺傳轉化的方法主要有PEG法、花粉管通道法、農桿菌法、基因槍法、電激法、子房注射法等，其中，農桿菌法和基因槍法使用較多[4]。農桿菌法具有成本低、外源基因拷貝數低、外源基因能穩定遺傳表達等特點，更適用于規?；D基因技術體系[1]。在農桿菌介導的遺傳轉化中，農桿菌侵染外植體必須有一定的時間，才能使農桿菌充分吸附到外植體的表面，此過程中許多因素的變化對轉化效率有較大的影響[5-6]。有關農桿菌轉化效率的影響因素已有大量研究報道[5，7-8]，但仍有許多未涉及的問題需要進一步探討。

共培養階段是農桿菌侵染轉化的關鍵階段，共培養條件不同將直接關系轉化是否成功，從而影響農桿菌對玉米的轉化效率，水分是共培養的重要因素之一，在共培養中如何控制水分是研究農桿菌轉化的一個重要方面。

玉米莖尖是近幾年遺傳轉化中廣泛應用的一種受體材料，與幼胚及其胚性愈傷組織等受體材料相比，莖尖作為受體材料具有簡單易行、周期短、效率高、取材不受季節限制等優點。GFP作為輔助性篩選標記基因可以直觀、快速和有效地消除玉米遺傳轉化工作中的假陽性現象；近幾十年來，GFP綠色熒光蛋白作為可視標記在生物學研究的各個領域均得到了廣泛的應用，成為了生物學研究最重要的手段之一[9]。

本研究利用GFP綠色熒光蛋白作為可視標記觀察轉化效果，在共培養階段，將已經在玉米芽生長點上滴加農桿菌侵染液的玉米種子，放到不同的水分狀態下進行共培養，目的是研究共培養時玉米種子處于不同的水分狀態下對農桿菌轉化玉米的影響，為提高玉米芽生長點的轉化效率提供試驗依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

利用玉米自交系鄭58的成熟種子，將種子發芽后剝出的芽生長點作為轉化受體。

所用載體PEGAD（Ubi+EGFP）由河北師范大學提供，含有增強型綠色熒光蛋白基因（EGFP），將35 S啟動子替換為ubiquition啟動子改造而成（圖1）；所用農桿菌菌株為EHA105，由河北省植物轉基因中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子發芽 將玉米種子清洗后，用0.1%的HgCl2消毒12 min，再用無菌水沖洗5遍，將消毒的種子放在加有2層濾紙經過高溫消毒的培養皿中（培養皿直徑9 cm），每培養皿放20粒玉米種子，5個培養皿共100粒種子，每個培養皿分別加8 mL濃度為70 μmol·L-1的AS（乙酰丁香酮）水溶液，在25 ℃暗培養3 d。

1.2.2 農桿菌介導轉化液的制備 挑取農桿菌單菌落，接種到50 mL含有50 mg·L-1硫酸卡那霉素+40 mg·L-1利福平的LB液體培養基中，于28 ℃，210 rpm條件下振蕩培養至菌液OD600=0.5時，4 000 r·min-1，5 ℃離心5 min收集菌體，棄上清液，懸浮于1 mL的高滲侵染基液。高滲侵染基液配方為：1/10 MS培養基的鹽+ 68.5 g·L-1蔗糖+30 g·L-1葡萄糖+400 mg·L-1 MES +100 μmol·L-1乙酰丁香酮+100 mg·L-1普朗尼克F68，pH值為5.4～5.6，搖勻制備成農桿菌介導轉化液。

1.2.3 轉化處理與檢測 當玉米種子浸種發芽3 d以后進行轉化處理，將發芽的種子在4 ℃冷處理31 h，然后在工作臺上放置30 min，用手術刀剝出玉米芽生長點。處理1：放入加有2層濾紙的培養皿中，處理1共轉化3個培養皿，每培養皿放10粒種子，在-18 ℃處理20 min，放置30 min，用農桿菌侵染液轉化處理，轉化30 min后，加1.5 mL水，蓋蓋后密封，放在23～25 ℃溫度條件下暗培養4 d，然后每培養皿加10 mL水，25℃光照培養。處理2：將剝出生長點的玉米種子放入1 mL的槍頭盒中，其中一盒放20粒種子，另一盒放17粒種子，在-18 ℃處理20 min，放置30 min，用農桿菌侵染液轉化處理，轉化30 min后，每盒加20 mL水，蓋蓋后密封，放在23～25 ℃溫度條件下暗培養4 d，然后每槍頭盒加20 mL水，進行光照培養1 d，轉接到加有2層濾紙的培養皿中，每培養皿放10粒種子加10 mL水，進行光照培養。轉化7 d后，用熒光顯微鏡對轉化芽進行熒光蛋白檢測，比較2個處理的轉化效果和轉化芽的獲得情況。

2 結果與分析

2.1 共培養條件對玉米發芽的影響

轉化后經過共培養6 d后玉米種子的出芽率，處理1為43.3%，處理2為12.5%；玉米種子的芽長度處理1較長，處理2很短（圖2c），說明處理2對轉化后玉米種子的發芽不利，獲得的轉化玉米芽較少。由此可見，使玉米種子直接接觸一定的水分（處理1），比只在濕度較大的水環境中（處理2）更有利于發芽。

2.2 共培養條件對轉化的影響

通過對轉化芽綠色熒光蛋白的檢測結果可知（圖3），處理1與處理2轉化后長出的玉米芽綠色熒光蛋白的表達亮度差異不明顯，表明這2種共培養方式對于農桿菌的侵染轉化效果基本沒有差異，農桿菌對玉米芽生長點的轉化需要的水分并不多，只要有一定的濕度即可完成侵染轉化過程，但水分過少時轉化后生長出的芽小，不利于轉化苗的形成。

3 討 論

共培養是農桿菌中T-DNA 攜帶外源基因進入植物細胞的關鍵時期。張麗君等[10]將第2 次超聲處理后的微創傷種子浸泡在含有目的基因農桿菌菌液中，于搖床上振蕩（ 120 r·min-1） 培養1～3 d，由于轉化材料為種子，需要考慮種子的發芽情況，共培養時間以2 d 較合適；共培養時間太短，農桿菌沒有充分地對植物進行轉化，轉化率較低；而共培養時間太長，胚細胞呼吸作用逐漸加強，酶的活動逐漸旺盛，加速消耗氧氣，使得共培養液中氧氣含量減少，營養情況不良，并容易大量產生、積累次級代謝產物，可能產生有害物質。由于他們利用農桿菌液與受體材料進行共培養，使得共培養時間不宜超過2 d，采用將農桿菌侵染液添加到玉米芽生長點上，向培養皿中添加少量的水，使玉米種子可以吸收到少量水分保持一定濕度，又不影響種子正常呼吸作用，這樣進行共培養，可以使共培養的天數增加到3～4 d，保證有充分的時間完成農桿菌的轉化過程，使更多的細胞得到轉化，又不會危害芽的生長。如果不使種子接觸到水分，僅保證種子處于較高的濕度環境，雖然可以完成農桿菌的轉化但對轉化芽的生長不利，不易獲得轉化植株。采用加較少的水分，在培養皿中密閉的方法共培養，有利于農桿菌完成轉化和獲得植株。

參考文獻：

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