兩種復合誘變方法選育擲孢酵母高產油脂菌株

劉 欣，朱健樹，劉楊洋，黃玉蕓，李子洋，許滋楊，韓玉成(.長春工業大學 化學工程學院，長春 3002；2.吉林省石化資源與生物質綜合利用工程實驗室，長春 3002)

近年來，能源危機和環境污染已成為全人類面臨的重大課題，其中石油供需矛盾尤為突出，研究新的可替代能源迫在眉睫[1]。生物柴油是新能源的一種，燃燒性能好，含硫量低，可代替化石燃料，且環?？稍偕鶾2]。目前生產生物柴油的主要原料為動植物油脂等可再生資源，但利用動植物油脂為原料成本高，其成本占到總生產成本的70%～85%，且受場地、季節、氣候的影響較大，經濟可行性差，制約了生物柴油的產業化進程。

微生物油脂又稱單細胞油脂[3]，是指由酵母、霉菌、細菌和藻類等微生物在一定條件下，利用碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂作為碳源，在菌體內產生的大量油脂[4]。微生物油脂具有發酵周期短，來源比較廣泛，不受季節、場地、環境變化影響等優點，是生物柴油產業和生物經濟的重要研究方向。其中酵母菌在油脂發酵過程中能積累較大的生物量，且原料來源廣泛，受到科研工作者的極大關注。擲孢酵母(Sporobolomycesreseus)是傳統的油脂生產菌，其質量的優劣對工業發酵至關重要。誘變是改良菌種的基本方法，但單獨使用一種誘變方法，誘變效率低，且易發生回復突變，因而通常采用物理化學復合誘變的方法改良菌種。目前，在其他酵母體系中采用的有效復合誘變方法是紫外(UV)與亞硝基胍(NTG)復合誘變和紫外(UV)與硫酸二乙酯(DES)復合誘變[5-6]?；诖?，本研究采用以上兩種復合誘變方式對原始菌株擲孢酵母As.2.618進行誘變育種，以篩選高產油脂突變株，進一步提高油脂產量及低溫流動性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

擲孢酵母(Sporobolomycesreseus)As.2.618，購自中國科學院微生物研究所菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

葡萄糖，酵母浸膏粉，瓊脂粉，蛋白胨，MgSO4·7H2O，KH2PO4，(NH4)2SO4，無水乙醇，氯化鈉，正己烷，石油醚，甲醇，二甲基亞砜，DES，NTG，淺藍菌素(Cerulenin)，馬來酰肼。

淺藍菌素母液(2.24×10-3mol/L)：5 mg淺藍菌素充分溶解于10 mL二甲基亞砜中。母液經過0.22 μm的濾膜過濾除菌備用。

2% DES溶液：取0.4 mL DES用少量乙醇溶解，再加2 mol/L pH 7.2的磷酸緩沖液，定容至20 mL。

1.1.3 培養基

斜面培養基：14%麥芽汁斜面培養基，pH 6.0～6.5，121℃滅菌30 min。

種子培養基：葡萄糖40 g/L，酵母膏0.5 g/L，MgSO4·7H2O 5 g/L，KH2PO41 g/L，(NH4)2SO45 g/L，pH 6.0～6.5，121℃滅菌30 min。

發酵產脂培養基：葡萄糖103 g/L，酵母膏11.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.15 g/L，KH2PO40.1 g/L，pH 6.0～6.5，121℃滅菌30 min。

普通平板培養基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，葡萄糖10 g/L，瓊脂20 g/L，pH 6.0～6.5 g/L，121℃滅菌30 min。

淺藍菌素篩選平板培養基：普通平板培養基(1 L)滅菌后降溫至50℃，分別向其中加入20、40、60、80、100、120、140、160 μL的淺藍菌素母液制成篩選平板培養基后倒平板。

馬來酰肼篩選平板培養基：向普通平板培養基中添加不同質量濃度的馬來酰肼至終質量濃度分別為1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 g/L。超聲溶解，滅菌后倒平板。

1.1.4 儀器與設備

超凈工作臺，紫外分光光度計，恒溫培養箱，恒溫水浴鍋，高壓蒸汽鍋，離心機，顯微鏡，電子分析天平。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化與發酵培養

菌種活化：將擲孢酵母As.2.618接于斜面培養基上26℃培養96 h。

種子擴大培養：將在斜面培養基上活化后的菌種接1環到液體種子培養液中，250 mL三角瓶裝液量為50 mL，培養條件為26℃，180 r/min，活化48 h。

發酵培養：將培養48 h后的種子液以10%的接種量接于發酵搖瓶進行發酵產脂。向裝液量為250 mL 三角瓶中裝入50 mL的發酵培養基，培養條件為溫度26℃，轉速180 r/min，培養120 h。

1.2.2 菌種選育

1.2.2.1 UV-NTG復合誘變及馬來酰肼篩選

紫外誘變：取對數生長期的菌體用無菌水配制成108個/mL菌懸液，置于功率15 W的紫外燈20 cm 處，磁力攪拌。紫外照射時間分別為10、20、30、40、50 s，以不同照射時間獲得不同誘變劑量[7]。誘變完畢后，在紅光下分別取0.10 mL的菌液進行平板涂布，26℃避光培養48 h后以未誘變菌液為對照，計算并繪制致死率曲線。選取致死率為70%～80%的紫外照射時間為最佳紫外誘變劑量。致死率=(對照組菌落數-誘變后菌落數)/對照組菌落數×100%。

NTG誘變：將經紫外誘變選育的突變株進行活化，用無菌水稀釋至108個/mL。以不同質量濃度NTG獲得不同誘變劑量[8]，向菌懸液中添加NTG至終質量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L。振蕩處理30 min后，將其涂布于普通平板培養基，26℃恒溫培養48 h，以未經誘變處理的菌液平板菌落作對照，計算致死率并繪制NTG致死率曲線。選取致死率為70%～80%的NTG終質量濃度作為最佳誘變劑量。

馬來酰肼初篩：經UV-NTG復合誘變后，挑取菌落較大且菌落形態與原始菌株的菌落形態有明顯不同的突變株活化，配制成108個/mL的菌懸液，分別取0.10 mL菌液涂布于1.1.3所示的不同終質量濃度的馬來酰肼篩選平板中，以未添加抑制劑的平板作對照，26℃恒溫培養48 h，計算存活率[9]并繪制馬來酰肼存活率曲線。存活率=誘變后菌落數/對照組菌落數×100%。

1.2.2.2 UV-DES復合誘變及淺藍菌素篩選

紫外誘變：采用1.2.2.1中所述最佳紫外誘變條件對原始菌株進行誘變，選育長勢較好的突變株。

DES誘變：將上述突變株活化后稀釋至108個/mL，分別取50 mL菌懸液，加入1.2 mL 2%DES溶液，以不同的DES處理時間獲得不同誘變劑量，振蕩處理40、60、80、100、120 min后[5]，加入10 mL質量分數為25%硫代硫酸鈉溶液終止反應。取0.10 mL誘變后菌液均勻涂布于普通平板培養基，26℃恒溫培養48 h后，計算并繪制DES致死率曲線。選取致死率為70%～80%的DES振蕩時間作為最佳誘變劑量。

淺藍菌素初篩：將UV-DES復合誘變選育出的突變株于淺藍菌素篩選平板上篩選，方法同1.2.2.1中馬來酰肼初篩。

1.2.2.3 突變株復篩及遺傳穩定性實驗

復篩：分別從兩種初篩平板中各挑選5株長勢較好的突變株，移至搖瓶進行發酵，通過生物量、油脂含量、油脂產量3個指標判斷菌株的誘變效果。

傳代：將上述油脂產量最高的突變株連續5次傳代培養后測定其生物量、油脂含量、油脂產量，并比較前后數值的變化。

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 生物量的測定

發酵液于7 000 r/min下離心5 min后，傾去上清液，沉淀(菌體)用蒸餾水離心清洗2次，轉入已經稱量好的稱量皿中，于90～100℃烘至恒重(含水量在4%以下)。生物量=干菌體質量/發酵液體積。

1.2.3.2 油脂的提取測定

采用酸熱法提取油脂[10]。

油脂產量=油脂質量/發酵液體積

油脂含量=油脂產量/生物量×100%

1.2.3.3 油脂脂肪酸分析

參照文獻[11]對油脂進行甲酯化，采用氣相色譜進行脂肪酸組分分析。氣相色譜條件：GC6890N氣相色譜儀，DB-23色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，FID檢測器，溫度250℃；載氣為氮氣，流速40 mL/min，氫氣流速40 mL/min，空氣流速350 mL/min；進樣模式為分流進樣，分流比30∶1；進樣口溫度250℃；進樣量1.0 μL；程序升溫為初溫120℃，保持2 min，以4℃/min升溫至200℃，保持22 min。

2 結果與分析

2.1 UV-NTG復合誘變及馬來酰肼篩選

2.1.1 紫外誘變劑量的確定

按1.2.2.1采用不同的紫外照射時間對原始菌株進行處理，以未經照射的菌株作為對照，通過平板活菌計數法計數照射后的活細胞含量，計算致死率。以紫外照射時間為橫坐標，致死率為縱坐標繪制致死率曲線，結果見圖1。

圖1 紫外照射時間對致死率的影響

由圖1可知，紫外照射時間對菌株致死率影響較大。在開始的20 s內，隨著紫外照射時間的延長，致死率顯著提升，此時致死率為69.48%；但 40 s 后致死率變化減緩，照射40 s和50 s時，致死率分別為84.08%和86.47%。較高的誘變指標(致死率)有利于篩選優良菌株，但如果紫外照射時間過長，則不利于篩選。因此，選擇70%～80%為目的致死率作為誘變劑量[12]。選擇紫外照射30 s為原始菌株的紫外誘變劑量，此條件下致死率為76.48%。

2.1.2 NTG誘變劑量的確定

NTG是有效的化學誘變劑，可以使DNA分子上的堿基及磷酸部分烷化，導致DNA復制時堿基配對錯誤而引起突變[13]。菌株菌懸液經不同終質量濃度的NTG誘變后致死率見圖2。

圖2 NTG終質量濃度對致死率的影響

由圖2可知，隨著NTG終質量濃度的增加，致死率逐漸升高。選取致死率70%～80%作為最佳誘變劑量，當NTG終質量濃度為0.08 g/L時，致死率為78.43%，在目標致死范圍之內。繼續提高NTG終質量濃度，菌體致死率迅速提高，當NTG終質量濃度達到0.10 g/L時，致死率為92.16%，菌體接近死亡。因此，選取0.08 g/L為NTG最佳誘變劑量。

2.1.3 馬來酰肼篩選

生物柴油中的油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸是經一系列脂肪酸脫氫酶脫飽和而產生的，其活性受到馬來酰肼的抑制，使其不能合成正常生理活動所必需的脂肪酸，從而抑制菌株的生長[14]。經馬來酰肼篩選后菌落存活率曲線見圖3。

圖3 馬來酰肼處理下擲孢酵母的菌落存活率

由圖3可知，隨著馬來酰肼終質量濃度的提高，原始菌株存活率逐漸下降。當馬來酰肼終質量濃度達到2.2 g/L時，菌落存活率僅為12.50%，因此選擇2.2 g/L的馬來酰肼作為篩選劑加入平板培養中，初步淘汰脂肪酸脫氫酶酶活較低、不足以維持菌株正常生長的突變株。

2.1.4 突變株復篩結果

從馬來酰肼初篩平板中挑選5株長勢較好的菌落進行復篩測定生物量、油脂含量及油脂產量，5株菌株分別命名為UV-NTG-1，UV-NTG-2，UV-NTG-3，UV-NTG-4，UV-NTG-5，結果見表1。

由表1可知，UV-NTG-2號菌株的生物量、油脂含量及油脂產量最大，分別為39.01 g/L、19.83%、7.74 g/L，較原始菌株分別提高了42.42%、52.30%、116.81%，因此選取該菌株作為UV-NTG復合誘變的最佳菌株，進行傳代培養，確定其遺傳穩定性。

表1 UV-NTG復合誘變突變株發酵結果

2.2 UV-DES復合誘變及淺藍菌素篩選

2.2.1 DES振蕩時間的確定

DES能使DNA烷基化，從而引起DNA復制時的轉換或顛倒而使物種突變或死亡。不同生物對DES的敏感程度不同，因此復合誘變前需確定菌株的最佳誘變條件[15]。DES振蕩時間對菌體致死率的影響結果見圖4。

圖4 DES振蕩時間對致死率的影響

由圖4可知，延長DES的振蕩時間會增加菌體DNA突變的概率，從而提高致死率。當DES振蕩時間為100 min時，致死率為70.14%，在目標致死范圍內。誘變時間為120 min時，致死率高達93.73%，菌體接近死亡。因此，DES振蕩時間選擇100 min。

2.2.2 淺藍菌素篩選

β-酮酯酰-ACP合酶是脂肪酸合成的關鍵酶，可被天然產物淺藍菌素進行不可逆抑制，與其活化位點的半胱氨酸上的巰基發生共價結合，形成內酰胺環而使之失活，從而抑制細胞的生長代謝[16-17]。因此，在含有一定濃度的淺藍菌素培養基上，只有脂肪酸合成酶活性較高的菌株才能存活下來而被選出。經1.2.2.2實驗結果確定，在淺藍菌素的作用下，僅有部分平板有少量菌落存活下來，且大小不一。經淺藍菌素篩選菌落存活率曲線見圖5。

由圖5可知，菌落的形成隨淺藍菌素添加量的增加而逐步減少，當淺藍菌素的添加量達到160 μL(17.92 μmol/L)時，擲孢酵母的菌落存活率為 9.80%，故以此添加量作為篩選處理的最佳劑量。

圖5 淺藍菌素處理下擲孢酵母的菌落存活率

2.2.3 UV-DES復合誘變及淺藍菌素篩選

從2.2.2淺藍菌素篩選平板中挑選其中5株長勢較好的菌落進行復篩，測定編號為UV-DES-1，UV-DES-2，UV-DES-3，UV-DES-4，UV-DES-5突變株的生物量、油脂含量及油脂產量，結果見表2。

表2 UV-DES復合誘變突變株發酵結果

由表2可知，UV-DES-2號菌株的生物量、油脂含量及油脂產量最大，分別為38.96 g/L、20.80%、8.10 g/L，較原始菌株分別提高了42.24%、59.75%、126.89%。因此，選擇UV-DES-2號菌株連續傳代培養，考察突變株的遺傳穩定性。從結果上看，兩種復合誘變方法都能使菌株的產油能力顯著提高，可以使油脂產量提高1倍以上，但UV-DES復合誘變方法略優于UV-NTG復合誘變方法。

2.3 油脂脂肪酸分析(見表3)

表3 油脂脂肪酸組成 %

由表3可知，突變株UV-DES-2與UV-NTG-2的脂肪酸組成中，C18∶1的相對含量最高，分別為80.54%和75.35%，分別較原始菌株提高了11.88 個百分點和6.69個百分點；雖然C18∶2含量分別較原始菌株降低了6.45個百分點和2.04個百分點，但十八碳不飽和脂肪酸的總量均較原始菌株有所提高(提高了5.43個百分點和4.65個百分點)；而C20∶1的相對含量均較原始菌株有所下降。在制備生物柴油時，油脂脂肪酸組成中飽和脂肪酸甲酯含量越高且長鏈脂肪酸甲酯含量越多，該生物柴油的低溫流動性越差，因此突變株油脂的流動性較原始菌株高。

2.4 突變株的遺傳穩定性(見表4)

表4 傳代后菌株的發酵結果

由表4可知，突變株UV-DES-2與UV-NTG-2連續傳至第5代的生物量與產油能力分別較第1代無顯著差異，說明兩種誘變菌株具有遺傳穩定性。

3 結 論

采用UV-NTG和UV-DES兩種誘變方法對擲孢酵母As.2.618進行誘變，得出在UV-NTG復合誘變及馬來酰肼篩選方法中，紫外最佳誘變劑量為30 s，NTG誘變劑量為0.08 g/L，馬來酰肼終質量濃度為2.2 g/L，此條件下獲得突變株UV-NTG-2的生物量、油脂含量、油脂產量分別為39.01 g/L、19.83%、7.74 g/L，較原始菌株分別提高了42.42%、52.30%、116.81%；在UV-DES復合誘變及淺藍菌素篩選中，紫外最佳誘變劑量為30 s，DES振蕩時間為100 min，淺藍菌素濃度為17.92 μmol/L，在此條件下獲得的突變株UV-DES-2的生物量、油脂含量、油脂產量分別為38.96 g/L、20.80%、8.10 g/L，較原始菌株分別提高了42.24%、59.75%、126.89%。連續傳代后油脂產量穩定，油脂的低溫流動性較原始菌株有所提高，具有遺傳穩定性。菌株UV-DES-2產油能力較強，生長性能良好，是一株具有開發前景的優良高產油脂菌株，以此菌株為基礎進一步提高油脂含量將是后續研究中需解決的關鍵問題。

[1] 王常文, 崔方方, 宋宇.生物柴油的研究現狀及發展前景[J].中國油脂, 2014, 39(5):44-47.

[2] WU S G, HU C M, JIN G J, et al.Phosphate-limitation mediated lipid production byRhodosporidiumtoruloides[J].Bioresour Technol, 2010, 101(15):6124-6129.

[3] ZHU L Y, ZONG M H, WU H.Efficient lipid production withTrichosporonfermentans and its use for biodiesel preparation[J].Bioresour Technol, 2008, 99(16):7881-7885.

[4] MITTELBACH M.Fuels from oils and fats: recent developments and perspectives[J].Eur J Lipid Sci Technol, 2015, 117(11):1832-1846.

[5] 李新社, 易自力, 陸步詩, 等.復合誘變皮狀絲孢酵母選育高產油脂菌株[J].中國油脂, 2010, 35(7):31-34.

[6] 趙豐麗, 黃翠, 陳睿.復合誘變對酵母產脂的影響及檢測方法的研究[J].中國油脂, 2007, 32(7):34-37.

[7] 李鴻梅, 苗琇巖, 魏明, 等.紫外與亞硝基胍復合誘變選育高產多糖羅耳阿太菌[J].食品工業科技, 2014, 35(20):244-247.

[8] 張祝蘭, 唐文力, 楊煌建, 等.UV與NTG復合誘變選育咪唑立賓高產菌[J].微生物學通報, 2010, 37(6):857-860.

[9] 劉勝男, 王亞洲, 石林霞, 等.γ-亞麻酸產生菌的低能離子束誘變選育[J].河南科技大學學報(自然科學版), 2015, 36(3):76-80.

[10] 孔凡敏, 趙祥穎, 田延軍, 等.酸熱法提取酵母油脂條件的研究[J].中國釀造, 2010(5):143-146.

[11] LIU X, ZHANG H M, JI X J, et al.An improved sampling protocol for analysis of intracellular metabolites inMortierellaalpina[J].Biotechnol Lett, 2012, 34:2275-2282.

[12] 李鴻梅, 苗琇巖, 魏明, 等.紫外與亞硝基胍復合誘變選育高產多糖羅耳阿太菌[J].食品工業科技, 2014, 35(20):244-247, 262.

[13] 苗蘭蘭, 張東杰, 王穎.復合誘變高產金屬硫蛋白酵母菌株的篩選[J].食品科學, 2013, 34(19):261-264.

[14] 戴群, 戴傳超, 顧敏.花生四烯酸高產菌株的誘變和篩選研究[J].食品科技, 2010, 35(1):19-22.

[15] 羅躍中, 蘭立新, 吳永堯.紫外線與硫酸二乙酯復合誘變選育高效油脂降解菌株[J].江蘇農業科學, 2012, 40(2):295-297.

[16] PTICE A C, CHOI K H, HEATH R J, et al.Inhibition ofbeta-ketoacyl-acyl carrier protein synthases by thiolactomycin and cerulenin[J].J Biol Chem, 2001, 276(9):6551-6559.

[17] 李仁民, 王菊芳, 馬爽, 等.利用脂肪酸合成酶抑制劑和磷酸香草醛反應篩選高產油脂酵母菌[J].微生物學通報, 2008, 35(4):545-549.