玉米單倍體育性自然恢復研究進展

楊繼偉，曲彥志，崔麗洋，毛熙嵐，劉宗華，李浩川

(河南農業大學 農學院/河南糧食作物協同創新中心,河南 鄭州 450002)

玉米單倍體只含有1套染色體組，在減數分裂過程中不能形成正常的配子，因而表現出高度不育，無法直接利用，只有通過染色體成功加倍，產生所有等位基因純合、正?？捎?DH)系后，才能用于玉米育種。近年來，由于單倍體育種逐步彰顯其獨特的優勢，該技術的相關研究越來越深入，從誘導基因的克隆和誘導機制的發現[1-2]，到新型高頻率孤雌生殖誘導系的選育[3-4]及高效自動化單倍體分選儀的成功研制[5]，使單倍體產生和鑒定效率得到了大幅度提高，極大地推動了該技術的規?；瘧?。然而，單倍體不能高效地成功加倍已是單倍體育種技術工程化應用的瓶頸。目前，化學藥劑處理是單倍體加倍的主要方法，但該方法費時費工，加倍過程也比較繁瑣，所利用的化學藥劑常常對人體和環境造成較大的危害[6]。所以，實現玉米單倍體育種規?；凸こ袒?，需要探索高效、簡便、快捷的單倍體加倍途徑。為此，對單倍體育性自然恢復的表現和影響因素以及育性自然恢復的有關機制進行了綜述，以期為玉米單倍體育種提供借鑒。

1　玉米單倍體育性表現

1.1　玉米單倍體雄穗自然恢復

單倍體植株在生長發育過程中能正常抽雄，由于只含有1套染色體組，表現高度不育，即使單倍體中的10條染色體在減數分裂過程中同時進入一個細胞，產生可育配子的概率也只有1/512，但在育種實踐過程中發現,不同遺傳背景的單倍體存在著不同程度的育性恢復，有的單倍體僅僅有一個或者幾個小穗能夠散粉，有的是一個或者幾個分支，也有少數的單倍體整個雄穗都可以散粉，這可能與單倍體細胞二倍化的早晚和程度有關，為單倍體的自然加倍提供了可能性[7]。Khoklov等[8]報道了單倍體在沒有經過化學處理或者物理因素影響下，二倍體細胞存在單倍體植株的任何部位組織，最多的組織細胞中二倍體細胞比例達到1.23%，并認為這是自然加倍的結果?？梢?，自然狀態下單倍體體細胞也具有一定的二倍化傾向。Chase[9]、魏俊杰等[10]分別對單倍體雄穗自然恢復進行了研究，結果表明,自然恢復率在10%左右，不同基因型之間差異顯著，變異系數達50%。也有研究表明,有的單倍體材料不具有自然二倍化的能力[11]。Shatskaya等[12]研究認為,單倍體雄穗的可育性程度是遺傳性狀，基因型來源不同的單倍體雄穗育性恢復能力差異很大，并在4個不同來源的單倍體材料發現雄穗育性恢復率具有顯著性的差異。

1.2　玉米單倍體雌穗自然恢復

Chalyk[7]利用來自10個馬齒型玉米的234個單倍體植株，并與混合的正常二倍體的花粉進行雜交授粉，其中僅有8個果穗未結實，結實最多的果穗可達到127粒，平均每個果穗結實26.6個籽粒。Geiger等[13]利用3個單倍體群體采取開放式和二倍體植株花粉授粉的方法觀察單倍體雌穗結實特性，發現最高單倍體結實數要超出平均每穗的結實粒數的3～6倍，其中第一個群體平均結實25～192粒。魏俊杰等[10]、劉志增等[14]研究結果也都表明，單倍體雌穗育性自然恢復率都達到90%以上。任姣姣[15]利用鄭單958的花粉對不同來源的22個自交系的單倍體的雌穗進行多次重復授粉，分析單倍體雌穗育性的恢復能力，結果表明，單倍體雌穗平均結實株率為89.54%，平均結實籽粒數為15.4個。由此可見，單倍體雌穗自然恢復為二倍化的能力遠遠高于雄穗，因此，單倍體雌穗育性自然恢復能力不是限制單倍體自然加倍的主要因素。

2　玉米單倍體自然恢復影響因素

2.1　母本遺傳背景的影響

單倍體自然加倍能力受母本材料基因型控制，研究結果表明，不同來源材料的單倍體，雄花自然恢復率不足5%，有的材料甚至不具有自然加倍的能力[11-12]。Chalyk[7]研究表明，單倍體雄穗育性自然恢復在不同單倍體材料間也存在顯著差異，不同基因型的自然加倍效率大約在0%～21.4%。許洛等[16]對5個來自國外血緣不同雜交種的單倍體進行自然恢復研究，結果表明，單倍體育性差異顯著，最高散粉率為13.8%，最低僅為0.57%，先玉808、MSD1和DMY1為自然加倍效果較好的材料。Shatskaya等[12]對613/2C4、Mol7、Ts8、Tsl6的單倍體進行研究，4個不同材料的單倍體雄穗育性自然恢復率分別是21.9%、1.2%、5.3%、3.4%。Kleiber等[17]在對早熟和溫帶2種不同玉米種質資源的單倍體自然加倍率的研究中，發現早熟種質來源的單倍體育性恢復效率高于晚熟品種，對于溫帶種質類型的材料，單倍體來源于骨干種質的散粉率及結實率比來源地方種質的高。

2.2　生態環境的影響

單倍體的生長環境對其自然恢復效率也有極大的影響。Kleiber等[17]在大田和溫室2種不同環境中利用當地玉米資源和熱帶玉米種質資源的單倍體對其育性恢復效率進行統計分析，結果表明，在溫室條件下單倍體的平均恢復率要遠高于大田單倍體的自然恢復率。許洛等[16]利用5份不同基因型材料的單倍體在石家莊春播和夏播以及海南冬播3個環境條件下對其單倍體自然加倍的效果進行研究發現，不同基因型材料間，不同生態環境下加倍效果差異顯著，海南冬播效果最好，其次為石家莊春播。段民孝等[18]和蔡泉等[19]也證明了甘肅和海南兩地的單倍體的自然加倍效率顯著高于黃淮海地區和東北地區。甘肅和海南單倍體自然加倍之所以效果較好，可能是因為兩地區整體氣溫相對比較穩定，尤其是在植株生殖器官從生長到成熟階段，不會經受較高的溫度，而且晝夜溫差比較大，有利于單倍體生殖生長的發育。劉志增等[14]的研究也表明在單倍體生長前期晝夜溫差的變化與單倍體雄穗育性恢復有顯著的相關趨勢。由此可見，選擇合適的種植環境，可以提高單倍體的育性恢復效率。

2.3　播期的影響

單倍體自然加倍還與播種時間有一定的關系，尤其在同一個區域內，不同播種時間對單倍體育性恢復有顯著的差異。王文潔等[20]在河南新鄉利用同一個材料的單倍體探索了10個不同播期對單倍體自然加倍的影響，結果表明，不同的播期對單倍體加倍率有明顯差異，在該地區4月27日至5月2日有利于單倍體自然加倍，加倍率在57%左右。劉德友等[21]在山東青島研究了不同基因型不同播期對玉米單倍體自然加倍的影響，結果表明，不同基因型單倍體自然散粉率差異很大，自然散粉率為6.56%～65.33%；夏播自然散粉率比春播高3.77%，自交結實率為6.23%～9.39%，比春播高2.37%；夏播更有利于單倍體自然散粉和自交結實。段民孝等[22]在華北地區研究19個玉米單倍體在春、夏播不同播種期對自然加倍率的影響，結果表明，該地區春播時期更利于玉米單倍體的自然加倍。單倍體育性自然恢復受環境影響較大。由于我國地域廣闊，不同地區的氣候環境相差很大，導致不同地區的最佳播種時期不一致，所以在選擇正確的播種地點的同時，也要考慮播種日期對單倍體自然加倍的影響，方可達到更好的加倍效果。

2.4　其他因素的影響

單倍體育性恢復不僅受到基因型和環境的影響而且還受到其他因素的影響。有研究表明，經過單倍體加倍成功的DH系，再進行誘導獲得的單倍體自然恢復率高達40%以上[23]，這可能是由于控制單倍體育性恢復的基因一直存在，導致單倍體自然加倍率較高。由于單倍體植株矮小，生長勢相對較低，尤其是進行生殖發育過程中，土壤營養、田間濕度以及光照時間和強度都將會影響到單倍體雄穗是否自然產生可育的花粉和結實率，由此可見，單倍體自然加倍受多種因素影響，因此，實現單倍體加倍基地化和專業化，提高單倍體加倍效率，是單倍體育種工程化的一項重要內容。

3　玉米單倍體育性自然恢復的細胞學機制

利用秋水仙素(Cochicine)[17,24-25]、APM(Amiprophosmethyl)[26]、氨磺樂靈(Oryzalin)[27]和氟樂靈(Trifluralin)[28]等化學藥劑進行單倍體化學加倍，取得了顯著的效果，普遍認為其加倍機制是這些化學藥劑降解了微管蛋白，抑制了紡錘絲的形成[29]，而紡錘絲在體細胞有絲分裂過程中和生殖細胞減數過程中期起著重要的作用，這種紡錘絲的異?，F象會造成正常的2個姐妹染色單體或同源染色體不能正常移向細胞兩極，從而引起單倍體細胞染色體加倍。但這些化學藥劑處理濃度過高、時間過長不僅加重藥害，還會產生畸形和多倍體現象；反之，處理濃度過低、時間太短則達不到預期加倍的效果，因此，合適的藥劑濃度和處理時間至關重要。

截至目前，玉米單倍體自然恢復的生物機制一直不清楚，但是幾乎所有的單倍體植株都存在自發二倍化的現象。Gayen 等[30]通過觀察單倍體花粉母細胞認為，單倍體能夠產生可育的花粉，這與細胞融合有關。Testillano等[31]對玉米小孢子進行培養，通過顯微鏡觀察發現，在培養到5～7 d發現有多核細胞存在的現象，提出了早期細胞核的融合是導致單倍體加倍的主要原因。吳鵬昊等[32]利用流式細胞儀對鄭單958誘導產生的單倍體在自然條件下的二倍化現象進行觀察發現，體細胞加倍與生殖細胞加倍并不顯著相關，而雌雄穗加倍存在差異，并且雌穗自然加倍率較高。目前關于單倍體染色體自然加倍有很多假說，比如核內復制、核內有絲分裂、花粉管中營養核和精子融合等，均可能導致自然加倍發生[33]。

4　玉米單倍體育性的遺傳機制

玉米單倍體育性自然恢復主要體現在雄穗和雌穗2個方面，早期對于單倍體雄穗和雌穗育性恢復沒有過多的研究，目前研究結果表明，單倍體育性自然恢復是由核基因所控制。吳鵬昊[34]對多個不同雜種優勢類群的自交系和雜交種的單倍體進行雄穗育性恢復研究發現，該性狀在不同遺傳背景的材料中表現出顯著的差異，并利用2個育性自然恢復能力較強的材料與恢復能力較低的材料進行正反交，對得到的F1的單倍體育性自然恢復進行比較分析，發現單倍體都具有恢復能力，并沒有顯著性差異，由此可見，單倍體育性自然恢復性狀不受細胞質基因的影響；又利用鄭單958 F2:3群體的單倍體，通過多年綜合試驗，定位到了控制單倍體雄穗育性自然恢復的基因位點，共檢測到8個有關的QTL位點，其中8號染色體上在不同年份間檢測到了一個共同的QTL位點。Ren等[35]利用2個單倍體雄穗育性恢復差異明顯的材料組配了F2:3單倍體群體，并通過多年多點試驗，對不同家系的單倍體雄穗育性觀察統計，結合分子數據進行QTL分析，共發現4個相關的QTL位點，其中3個QTL位點均在單倍體群體中檢測到，同時檢測到了1個位于第6染色體的主效QTL，介于IND166和IND1668兩個標記之間。此外，河南農業大學也利用分離群體在鄭州和海南2個不同的環境下對單倍體雄穗自然恢復進行QTL分析，檢測到了3個共同的QTL與該性狀相關。隨著研究的不斷深入，控制單倍體雄穗自然恢復的基因將被克隆，為提高單倍體自然恢復能力提供更強的理論支撐。

5　展望

玉米單倍體育種技術已與轉基因技術、分子標記輔助選擇技術一起成為現代玉米育種三大核心技術[36]，高效的玉米單倍體育種技術體系，將會大大提升我國的玉米育種水平，加速突破性品種的培育，提升種子企業的市場競爭力。單倍體加倍作為單倍體育種技術體系的關鍵環節，尤其是自然加倍，由于具有簡便、快捷的優勢，更會引起高度重視，可以圍繞以下幾個方面開展工作：(1)加強單倍體自然加倍分子機制的研究，開發出功能標記，用于實踐中，實現單倍體自然加倍的高效化；(2)探索出不同來源基因型與加倍環境的互作效應，找出最適合單倍體自然加倍的區域，實現單倍體自然加倍的基地化；(3)根據自然加倍的特點，培訓一批技術人員，熟練掌握基地管理、自然加倍的識別、自交授粉等技術，實現自然加倍操作的專業化。隨著研究的不斷深入，研制出高效的玉米單倍體自然加倍技術，不僅可以確保人員和環境的安全，還可以減少其他加倍方法繁瑣的過程，節省人力物力，節約育種成本，并將加速玉米單倍體工程化育種進程。