毛霉型豆豉發酵菌株分離鑒定與酶活分析

任璐，劉思雨，鐘燕，索化夷*

(1.西南大學 食品科學學院，重慶 400715；2.重慶第二師范學院 重慶市功能性食品協同創新中心，重慶 400067)

參與豆豉發酵的微生物與豆豉品質、風味及酶活等密切相關。豆豉制曲階段的優勢霉菌是總狀毛霉[5]，豆豉中纖維素酶、蛋白酶等酶活性決定了粗纖維、蛋白質等降解速度，影響豆豉的色澤變化、質構變化[6]。毛霉型豆豉采用自然發酵工藝，發酵周期長，沒有一種優良而穩定的發酵劑。張雨浩等[7]發現酶通過催化蛋白質降解，為黑色素形成提供底物。孫森等[8]分析了天然發酵豆豉中的微生物菌相及關鍵酶酶活變化。目前對毛霉型豆豉微生物區系、黑色素形成機理等方面的深入研究較多，但對毛霉菌株發酵能力的評價較少。

本文從永川豆豉和三臺豆豉中分離得到2株總狀毛霉，對其蛋白酶、纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的酶活力進行分析，對傳統毛霉型菌株間的差異做一簡要闡述，為毛霉型豆豉安全高效發酵劑的研發，實現豆豉的規?；I生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

該實驗材料采自永川豆豉食品有限公司和四川省三臺縣三臺農產品開發有限責任公司。

1.2 實驗試劑

美國OMEGA公司生產的真菌DNA提取試劑盒(Fungal DNA Min Kit)、dNTP Mixture(10 mmol/L)、Taq Plus(5 U/μL)、10×Taq Plus Buffer(含Mg2+)、6×DNA Loading Buffer、λDNA/HindⅢMarker、LD2000 plus DNA Ladder、Gold View Ⅰ型核酸染料、50×TAE；

福林試劑(Folin試劑)、3，5-二硝基水楊酸(DNS)、三氯乙酸、干酪素、水楊素等均為分析純(AR)；

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)[9]、麩皮培養基。

1.3 實驗儀器

Mini-PROTEAN Tetro Cell核酸電泳系統 美國Bio-RAD公司；G:Box EF 凝膠成像系統 英國Syngene公司；EDC-810 雙槽PCR儀 東勝創新生物科技有限公司；光學顯微鏡。

1.4 實驗方法

1.4.1 毛霉的分離純化

取永川豆豉樣品25 g至錐形瓶中，加225 mL滅菌純水，于攪拌器上攪拌均勻。取1 mL上清液于EP管中，即為10-1稀釋度的樣液，依次按10倍稀釋6次，分別得到10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7稀釋度的樣液。取0.1 mL不同稀釋度的樣液，涂布PDA平板，每種稀釋度做3個平行平板，倒置在28 ℃恒溫培養箱中培養，每隔24 h觀察1次。3～5天后根據菌落形態和孢子顏色分離平板上生長的所有菌種，在PDA平板中劃線接種于28 ℃培養，3～5天后重復分離步驟，直至分離出所有純化菌種，并在光學顯微鏡下觀察找到毛霉菌落。三臺豆豉做相同處理。

1.4.2 分離菌株的分子生物學鑒定

1.4.2.1 DNA的提取

參考Chen等[10]的方法，用真菌DNA試劑盒(Fungal DNA Min Kit)提取毛霉DNA。

1.4.2.2 PCR擴增

取5 μL引物NS1(5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')、5 μL引物Fung(5'-ATTCCCCGTTACCCGTTG-3')、5 μL dNTP Mixture(10 mmol/L)、5 μL Taq Plus(5 U/μL)、25 μL 10×Taq Plus Buffer(含Mg2+)和195 μL滅菌超純水混勻。取24 μL混合液與1 μL提取的DNA樣品配成PCR體系，另取24 μL混合液加入1 μL滅菌超純水作空白，放入PCR儀中進行相應的PCR，得到PCR擴增產物。

1.4.2.3 DNA的電泳

選用0.8%的瓊脂糖凝膠，5 μL λDNA/HindⅢMarker加入樣品池的一端，1 μL 6×DNA Loading Buffer與5 μL DNA樣品混勻后依次加入樣品池。在80 V恒定電壓下電泳50 min，在凝膠成像系統中觀察結果并分析。

用1.4%的瓊脂糖凝膠對PCR擴增產物進行電泳檢測，5 μL D2000plus DNA Ladder加入樣品池的一端，其他條件同上。

1.4.2.4 測序與鑒定

PCR產物測序由華大基因完成，測序結果通過NCBI中的BLAST程序尋找與其有最大同源性的序列，最終確定2株菌的種屬關系。

1.4.3 測定酶活

1.4.3.1 制備待測酶液

純化的毛霉接種到麩皮培養基，培養48天后加pH為7.2的磷酸緩沖液10 mL，破碎后在40 ℃抽提1 h，離心(3500 r/min)，離心液備用。

1.4.3.2 蛋白酶活測定

參照GB/T 23527-2009的方法測定[11]。

繪制標準曲線:以不同濃度的酪氨酸與福林試劑反應測出的OD660值為橫坐標，酪氨酸的濃度為縱坐標，繪制成標準曲線。

取待測離心液1 mL于40 ℃水浴預熱2 min，加1 mL同樣預熱的酪蛋白，精確保溫10 min后加0.4 mol三氯乙酸2 mL，保溫20 min使殘余蛋白質沉淀后離心。另取試管加濾液1 mL，0.4 mol碳酸鈉5 mL和福林試劑1 mL，搖勻后40 ℃保溫發色20 min并進行光密度(OD)測定。每個樣品做3個平行和空白對照?？瞻讓嶒炘诩永业鞍字跋燃?.4 mol三氯乙酸2 mL使酶失活，其他測定方法相同。

結果處理得到樣品蛋白酶活力單位如下：

式中：A為由樣品測得OD值，查標準曲線得相當的酪氨酸微克數(或OD值×K)；4為4 mL反應液取出1 mL測定；N為酶液稀釋的倍數；10為反應10 min；W為樣品水分百分含量。

1.4.3.3 纖維素總體酶活測定(FPA活力單位測定)

繪制標準曲線：取不同濃度的標準葡萄糖溶液和DNS顯色劑各2 mL，沸水浴10 min后定容至15 mL，測OD550值。以OD值為橫坐標，葡萄糖的mg數為縱坐標繪制標準曲線。

試管內加0.2 mL待測酶液和pH為4.8醋酸緩沖液1.8 mL，預熱至50 ℃后加1×6 cm濾紙條，在50 ℃恒溫水浴60 min，加DNS顯色劑2 mL并沸水浴加熱10 min，冷卻后加水至15 mL，測OD550值。

1.4.3.4 β-葡萄糖苷酶活測定(Cb酶活力單位測定)

參照Cheng[12]的方法，改進后進行毛霉β-葡萄糖苷酶活測定。

試管內加0.2 mL待測酶液和1.8 mL水楊素(1%)，置50 ℃恒溫水浴60 min后加DNS顯色劑2 mL，沸水浴加熱10 min，冷卻后加水至15 mL，測OD550值。

結果處理，得到纖維素酶活力活力單位如下：

式中：x為樣品OD值的平均值；b和a由葡萄糖濃度和相應的OD值通過回歸方程求得；n為酶液稀釋的倍數；T為酶促反應的時間；0.2為所加酶液的量。

2 結果與分析

2.1 電泳圖像分析

提取不同毛霉的總DNA時，YC-1在Marker 23130 bp附近出現條帶，條帶完整，樣本提取成功，得到目的片段。

圖1 提取不同毛霉的DNA片段的圖像Fig.1 The image of DNA's fragment extraction from different mucor

注：M為Marker，1為空白，2和3為YC-1，4和5為ST-1。

由圖1可知，提取不同毛霉的DNA片段時，在Marker附近出現2，4，5號3條條帶，條帶清晰明亮，陰性對照無條帶，2個樣本擴增成功。

2.2 菌株鑒定

表1 兩株菌種的鑒定Table 1 Identification of two kinds of strains

由表1可知，菌株YC-1和ST-1鑒定成功，片段長度分別為677和679，同源性都為99%，鑒定出2株菌種皆為總狀毛霉。

2.3 酶活比較

圖2 酪氨酸標準曲線Fig.2 Standard curve of tyrosine

根據標準曲線計算樣品的蛋白酶活。在40 ℃下每1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位。

圖3 葡萄糖標準曲線Fig.3 Standard curve of glucose

由圖3可知，樣品的纖維素總體酶活和β-葡萄糖苷酶活。1 mL酶液在50 ℃，pH為4.8條件下，每1 min水解1×6 cm的濾紙產生1 μg還原糖(以葡萄糖計)的酶量定義為1個纖維素總體酶活力單位。1 mL酶液于50 ℃，pH為4.8條件下，每1 min水解1%水楊素溶液產生1 μg還原糖(以葡萄糖計)的酶量定義為1個β-葡萄糖苷酶活力單位。

表2 兩種毛霉的酶活比較Table 2 Comparison of enzyme activities of two kinds of mucor U/mL

蛋白酶活性是評價豆豉發酵過程的重要指標，蛋白酶將大分子蛋白水解成小分子多肽和氨基酸以及各種香氣成分。蛋白酶活性高低反映了豆豉中蛋白質水解的速度，決定了豆豉發酵成熟的周期[13]。在以蛋白質為主要成分的大豆制品中，蛋白酶活力的高低對豆豉發酵過程及蛋白質降解有重要影響。如果豉曲的質量不高，分泌的蛋白酶不足，影響成品成熟時間和營養價值[14]。

由表2可知，YC-1和ST-1的蛋白酶活分別為176.891 U/mL和51.201 U/mL，且YC-1的蛋白酶活性明顯高于ST-1。與索化夷等研究發現永川豆豉制曲過程中酸性蛋白酶的最高酶活性291 U/g相比較低，發酵后階段永川豆豉蛋白酶活力降低到50～175 U/g。在自然發酵條件下，曲霉型自然發酵豆豉過程中的蛋白酶活性最高為190.24 U/g[15，16]，與YC-1相比差異不大，與ST-1的差異很大。在曲霉型和毛霉型豆豉研究中也表明可以通過降低食鹽含量，提高蛋白酶活性的方法縮短發酵周期。選育高活性蛋白酶產生菌是縮短發酵周期和提高風味最簡單和行之有效的方法[17]。

豆豉發酵過程中纖維素酶活性高低決定了大豆纖維素的降解程度，大豆纖維素的降解會降低豆豉的硬度、彈性和咀嚼度等質構指標。由表2的測定結果發現，YC-1和ST-1的纖維素總體酶活分別為107.645 U/mL和66.762 U/mL，YC-1的酶活顯著高于ST-1的酶活。索化夷等[18]發現在毛霉型制曲階段，豆豉纖維素酶活由發酵初期的0.54 U/g上升到制曲結束時的1.37 U/g，進入后發酵階段纖維素酶的活性開始下降，在豆豉成熟時僅為0.03 U/g。以上表明YC-1和ST-1的纖維素總體酶活較高，其中YC-1的酶活高于ST-1的酶活。

微生物分泌β-葡萄糖苷酶作用于異黃酮糖苷，將大豆中糖苷型異黃酮向苷元型異黃酮轉化，而苷元型異黃酮更具有功能活性。因而，對β-葡萄糖苷酶活性的研究有助于提高發酵豆制品的功能物質。由表2可知，YC-1和ST-1的β-葡萄糖苷酶活分別為80.430 U/mL和95.362 U/mL，且ST-1的酶活稍高于YC-1的酶活。β-葡萄糖苷酶作用于異黃酮，增強了發酵豆制品的功能性，為功能性豆豉的生產提供了參考。

3 結論

毛霉是毛霉型豆豉發酵的主要菌株，其優勢霉菌是總狀毛霉。從永川豆豉和三臺豆豉中分離到2株毛霉YC-1和ST-1，經分離、純化、測序，鑒定為總狀毛霉。

2株總狀毛霉3種酶的酶活不同，YC-1和ST-1產蛋白酶活分別為176.891 U/mL和51.201 U/mL；產纖維素總體酶活分別為107.645 U/mL和66.762 U/mL；產β-葡萄糖苷酶活分別為80.430 U/mL和95.362 U/mL?？傮w來說，YC-1酶活力情況高于ST-1的酶活力。

[1]Wang D,Wang L J,Zhu F X,et al.In vitro and in vivo studies on the antioxidant activities of the aqueous extracts of Douchi (a traditional Chinese salt-fermented soybean food)[J].Food Chemistry,2008,107(4):1421-1428.

[2]Liu Y Q,Wang L J,Cheng Y Q,et al.Isoflavone content and anti-acetylcholinesterase activity in commercial douchi:a traditional Chinese salt-fermented soybean food[J].Japan Agricultural Research Quarterly,2009,43(4):301-307.

[3]Li F J,Yin L J,Lu X,et al.Changes in angiotensin I-converting enzyme inhibitory activities during the ripening of douchi (a Chinese traditional soybean product) fermented by various starter cultures[J].International Journal of Food Properties,2010,13(3):512-524.

[4]Wang H,Li Y Y,Cheng Y Q,et al.Effect of the maillard reaction on angiotensin i-converting enzyme (ace)-inhibitory activity of douchi during fermentation[J].Food and Bioprocess Technology,2013,6(1):297-301.

[5]索化夷,趙欣,騫宇,等.永川毛霉型豆豉在發酵過程中微生物總量與區系變化規律[J].食品科學,2015,36(19):124-131.

[6]Rhyu M,Kim E.Umami taste characteristics of water extract of Doenjang,a Korean soybean paste:low-molecular acidic peptides may be a possible clue to the taste[J].Food Chemistry,2011,127(3):1210-1215.

[7]張雨浩,馬良,周夢柔,等.永川豆豉發酵過程中蛋白水解作用與黑色素形成關系[J].食品科學,2013,34(19):195-199.

[8]孫森.天然發酵豆豉后發酵過程的動態分析[D]．濟南：山東輕工業學院，2008.

[9]張初署,劉陽,邢福國,等.七種培養基對黃曲霉分離效果的比較[J].核農學報,2013,27(2):208-212.

[10]Chen A J,Tang D,Zhou Y Q,et al.Identification of ochratoxin:a producing fungi associated with fresh and dry liquor rice[J].Plos One,2013,8(10):78285.

[11]GB/T 23527-2009，蛋白酶制劑[S].

[12]Cheng Y Q,Zhu Y P,Hu Q,et al.Transformation of isoflavones during Sufu (a traditional chinese fermented soybean curd) production by fermentation with Mucor flavus at low temperature [J].Inter J Food Prope,2011,14(3):629-639.

[13]劉錦繡.豆豉混菌發酵及其功能成分的研究[D].泰安：山東農業大學,2013.

[14]索化夷,盧露,吳佳敏,等.永川豆豉在傳統發酵過程中基本成分及蛋白酶活性變化[J].食品科學,2011,32(1):177-180.

[15]管泳宇.曲霉型豆豉發酵分析及人工接種發酵研究[D].揚州：揚州大學,2013.

[16]管泳宇,于海,葛慶豐,等.曲霉型豆豉后發酵過程的初步研究[J].食品與生物技術學報,2013(2):212-218.

[17]楊林,王筱蘭,楊慧林,等.1株傳統曲霉型豆豉中高活力蛋白酶產生菌的分離及其鑒定[J].江西師范大學學報(自然科學版),2015(5):497-501.

[18]索化夷,趙欣,騫宇,等.永川豆豉發酵過程中質構色澤形成規律[J].食品與發酵工業,2016,42(7):80-85.