細胞極性相關蛋白CDC42和PAR3在小鼠牙胚發育過程中的表達

李 媛，史 冊，張 雪，趙 歡，郝新青，胡 月，劉蒼維，周怡君

閆廣興2,3，張穎麗1，孫宏晨2,3

(1.吉林大學口腔醫院牙體牙髓病科，吉林 長春 130021；2.吉林省牙發育及頜骨重塑與再生重點實驗室，吉林 長春 130021；3.吉林大學口腔醫院病理科，吉林 長春 130021)

牙發育是一個連續的過程，根據形態變化可分為蕾狀期、帽狀期和鐘狀期3個時期。分化成熟的具有分泌功能的成牙本質細胞的細胞器主要分布于分泌端胞漿內，呈高柱狀排列，這種形態及功能上不對稱分布稱為成牙本質細胞的極化[1]。細胞的極性[2]是某些胞質成分不對稱，這種特定的空間分布會促進不同的細胞行為，如分化、局部細胞膜增長、免疫系統激活、定向細胞遷移和分子的跨膜運輸。對于哺乳動物，上皮細胞是研究細胞極性形成的典型模型，其極性的建立需要細胞連接作為外在啟動信號，最終形成頂底極性 (apical-basal polarity，A-B極性)[3]。在A-B極性形成的過程中，細胞連接的形成作為極性信號，指導PAR極性復合體定位于細胞頂端[4]。PAR極性復合體由PAR3、PAR6與aPKC組成，可與Rho GTPase信號相互作用，參與極性的維持和調控[5]。PAR極性復合體成員之一的PAR3還參與細胞連接的形成[6]。CDC42作為Rho家族的一員，不僅參與細胞分裂、細胞遷移和偽足形成等 ，還參與極性復合物的形成，是細胞極化的中心，并調控多種極性形成的信號通路[7-9]。然而，關于CDC42和PAR3在牙發育中的時空表達及其對成牙本質細胞與成釉細胞極性作用的相關研究較少。本研究通過對小鼠牙發育期不同階段的牙胚(蕾狀期、帽狀期、鐘狀早期和鐘狀晚期)進行免疫組織化學染色，觀察CDC42和PAR3在牙胚發育過程中的表達，初步探討其在成牙本質細胞和成釉細胞極性形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物成年雄性C57小鼠10只，體質量約20 g；成年雌性C57小鼠20只，體質量約24 g；均購自吉林大學實驗動物中心(清潔級)，動物許可證號：SCXK(吉)2013-0001。所有小鼠狀況良好，無系統性疾病。

1.2 主要試劑和儀器15% EDTA脫鈣液和4%多聚甲醛(北京化學工業集團有限責任公司)，兔抗小鼠CDC42單克隆抗體(美國Abcam公司)，兔抗小鼠PAR3多克隆抗體(美國Proteintech公司)，免疫組織化學試劑盒(KIT-9706，福建邁新生物技術開發有限公司)，DAB(ZLI-9019，北京中杉金橋生物科技有限公司)。 切片機，體視顯微鏡(SZX16)和電子顯微鏡(Vanox)(日本Olympus公司)。

1.3 標本制備及處理1只雄性小鼠與2只雌性小鼠合籠，次日上午觀察陰栓，以查到陰栓當天記為胚胎0.5 d(embryonic day 0.5，E0.5)。胚胎小鼠發育至13.5、14.5、16.5和18.5 d(E13.5、E14.5、E16.5和E18.5)，取孕鼠脫頸處死后，取出子宮，于體式顯微鏡下分離小鼠胚胎，取小鼠頭部，4%多聚甲醛4℃固定24 h，乙醇梯度脫水，過二甲苯，標本透明，浸蠟、包埋。取出生后1 d(postnatal day 1，PN1)和出生后5 d(PN5)的小鼠頭部，4%多聚甲醛4℃固定24 h，15% EDTA脫鈣1周，脫水、浸蠟、包埋。

1.4 HE染色制備E13.5、E14.5、E16.5、E18.5、PN1和PN5小鼠下頜第一磨牙牙胚連續切片，常規HE染色，光鏡下觀察小鼠牙胚蕾狀期(E13.5)、帽狀期(E14.5)、鐘狀早晚期(E16.5和E18.5)組織形態表現以及PN1和PN5小鼠牙冠發育情況。

1.5 免疫組織化學染色切片烤片1 h后，常溫下脫蠟至水，PBS沖洗3 min×3次，EDTA(pH9.0)修復液微波修復，PBS沖洗3 min×3次，滴加3% H2O230 min，PBS沖洗3 min×3次；羊血清封閉30 min后加一抗，分別為兔抗鼠CDC42單克隆抗體和PAR3多克隆抗體，4℃過夜；PBS沖洗5 min×3次；滴加羊抗兔生物素標記二抗(北京中杉)10 min，PBS沖洗5 min×3次；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素抗生物素工作液，常溫20 min，PBS沖洗5 min×3次；滴加新鮮配置的DAB顯色液鏡下顯色，終止后蘇木素復染，樹膠封片。鏡下觀察并拍照?？瞻讓φ找訮BS代替一抗。

2 結 果

2.1 不同時間小鼠胚胎圖像體式顯微鏡下不同時間小鼠胚胎圖像見圖1(插頁二)。

2.2 蕾狀期、帽狀期和鐘狀早期小鼠牙胚組織形態表現及CDC42和PAR3的表達E13.5是小鼠牙胚發育的蕾狀期。HE染色：牙板上皮向間充質處延伸，形成上皮芽，形狀類似于花蕾，是成釉器的始基。在上皮芽周圍外胚間充質處細胞增生，包繞著上皮芽(圖2A和B，見插頁二)。免疫組織化學染色：CDC42在口腔上皮與外胚間充質處均有較為廣泛的表達，在上皮芽及其周圍的外胚間充質處表達較多(圖2C，見插頁二)。PAR3在上皮芽及其周圍外胚間充質處有少量表達(圖2D，見插頁二)。

E14.5是小鼠牙胚發育的帽狀期。HE染色：牙蕾向外胚間充質處生長，周圍外胚間充質細胞密度增加，此時出現細胞的分化，成釉器分化為3層細胞，包括外釉上皮、內釉上皮和星網狀層(圖2E和F，見插頁二)。免疫組織化學染色：CDC42于口腔黏膜上皮、外釉上皮、內釉上皮、星網狀層細胞的胞漿及外胚間充質均有表達(圖2G，見插頁二)。PAR3在口腔黏膜上皮和外胚間充質均有表達，在成釉器的外釉上皮、內釉上皮及星網狀層的胞漿有少量表達(圖2H，見插頁二)。

E16.5是小鼠牙發育的鐘狀早期。HE染色：成釉器體積進一步變大，成釉器進入成熟期，分化為4層，分別為外釉上皮層、內釉上皮層、中間層和星網狀層。內釉上皮與外釉上皮在頸環處增生，向間充質處嵌入性增長，在未來牙尖頂部還可見釉結(圖2I和J，見插頁二)。免疫組織化學染色：CDC42在外釉上皮與內釉上皮胞漿處高表達，星網狀層和牙乳頭細胞胞漿也有表達(圖2K，見插頁二)。PAR3在外釉上皮、內釉上皮、牙乳頭和星網狀層細胞胞漿處有表達(圖2L，見插頁二)。

2.3 鐘狀晚期小鼠牙胚組織形態表現及CDC42和PAR3的表達E18.5是小鼠牙發育的鐘狀晚期。HE染色：內釉上皮細胞向前成釉細胞分化(圖3A和B，見插頁二)。免疫組織化學染色：CDC42在內釉上皮細胞胞漿中表達強于其在牙乳頭細胞的表達(圖3C和D，見插頁二)。PAR3表達于內釉上皮與牙乳頭細胞胞漿，并且PAR3在內釉上皮中的表達強于牙乳頭(圖3E和F，見插頁二)。

PN1仍處于小鼠牙發育鐘狀晚期。HE染色：分化的成釉細胞與成牙本質細胞，成牙本質細胞與成釉細胞為高柱狀，呈柵欄狀緊密排列，此時有前期牙本質形成(圖4A和B，見插頁二)。免疫組織化學染色：CDC42表達于成牙本質細胞及成釉細胞的分泌端，在牙乳頭處的表達較成牙本質細胞處減少(圖4C和D，見插頁二)。PAR3在成釉細胞和成牙本質細胞分泌端表達較高，在星網狀層以及牙乳頭細胞胞漿中也有少量表達(圖4E和F，見插頁二)。

PN5時，HE染色:小鼠上皮根鞘開始向根方延伸，已有釉質和牙本質形成，成釉細胞和成牙本質細胞呈高柱狀緊密排列(圖5A和B，見插頁三)。免疫組織化學染色：CDC42在成釉細胞和成牙本質細胞分泌端表達較高(圖5C和D，見插頁三)，PAR3在成牙本質細胞和成釉細胞分泌端表達較弱(圖5E和F，見插頁三)。

3 討 論

本研究結果顯示：CDC42在小鼠牙胚發育的整個過程均有表達，同時在小鼠口腔黏膜上皮與周圍的外胚間充質等處均有不同程度的表達，該結果與張文菲等[10]研究結果基本一致。牙發育起始階段中重要的細胞生物學行為之一是細胞的增殖[11]。CDC42通過其下游分子鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors，GEFT)誘導細胞的增殖[12]。CDC42表達于蕾狀期、帽狀期和鐘狀早期牙胚且在以上各期上皮處表達量較間充質處高，其可能參與了早期牙發育過程中上皮細胞向間充質處的增殖和遷移。研究[13]表明：CDC42參與了上皮細胞黏附連接與緊密連接的形成 。在鐘狀晚期，前成釉細胞排列緊密，內釉上皮向前成釉細胞分化，CDC42表達于內釉上皮細胞的胞漿，并且CDC42于此期的表達弱于鐘狀早期牙胚表達，推測CDC42可能主要參與了鐘狀晚期牙胚內釉細胞連接的形成，此期上皮細胞的增殖遷移減弱。CDC42表達于PN1和PN5小鼠牙胚的呈高柱狀極化形態的成牙本質細胞、成釉細胞分泌端，并且其表達強于E18.5小鼠。細胞極性的建立包括細胞連接的建立與極性復合物的形成[14]，出生后小鼠成牙本質細胞和成釉細胞分泌端有緊密連接相關蛋白定位[15],CDC42還參與極性復合物的形成[13]，CDC42作為極性相關蛋白于此期表達增強，表明其可能對成牙本質細胞和成釉細胞極性建立有重要作用。

極性分子PAR活化會引起一系列細胞效應，如遷移細胞頭尾軸的形成、細胞的不對稱分裂以及上皮細胞頂底極性的建立等。本研究結果顯示：PAR3參與小鼠牙胚發育的整個過程。在牙胚發育蕾狀期，上皮芽增殖能力較強尚未出現細胞分化[16]，PAR3在上皮芽處表達較低；在帽狀期與鐘狀早期，PAR3在成釉器的外釉上皮以及內釉上皮處表達較蕾狀期高。在鐘狀晚期，PAR3在前成釉細胞表達但其表達明顯弱于其在鐘狀晚期時的表達，此時細胞呈高柱狀排列緊密，由于PAR3還參與極性復合物的形成[5]和細胞連接的建立[6]。本文作者推測：PAR3在此期的表達可能參與了前成釉細胞細胞連接的建立及其極性復合物的形成。PN5小鼠牙胚成牙本質細胞和成釉細胞分泌端PAR3表達與出生后PN1其表達量接近，細胞頂端連接復合體定位于此，PAR3對成牙本質細胞和成釉細胞極性的建立可能發揮重要作用。

綜上所述，細胞極性相關分子CDC42和PAR3表達于小鼠牙胚發育的整個過程。在牙胚發育的早期階段，CDC42和PAR3可能參與了細胞的增殖；在牙胚發育的晚期階段，從前成釉細胞開始到成釉細胞和成牙本質細胞極性形成，CDC42與PAR3可能參與了成牙本質細胞和成釉細胞的極性建立。但關于CDC42與PAR3在牙胚發育過程中增殖和細胞極性形成中的具體作用及其分子機制仍需進一步研究。

[1] Tj?derhane L, Koivum?ki S, P??kk?nen V，et al. Polarity of mature human odontoblasts[J]. J Dent Res, 2013, 92(11):1011-1016.

[2] David G, Drubin W, Nelson J.Origins of cell polarity[J].Cell,1996, 84(3):335-344.

[3] Coopman P, Djiane A. Adherens junction and E-cadherin complex regulation by epithelial polarity[J]. Cell Mol Life Sci, 2016, 73(18): 3535-3553.

[4] Selamat W,Tay P-LF, Baskaran Y, et al. The Cdc42 effector kinase PAK4 localizes to cell-cell junctions and contributes to establishing cell polarity [J].PLoS One, 2015,10(6): 129-134.

[5] Bertha C, Amrita D, Diptiben V, et al.Cdc42 regulates epithelial cell polarity and cytoskeletal function during kidney tubule development[J]. Cell Sci,2015,128(23): 4293-4305.

[6] Weng M, Wieschaus E. Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning[J]. Dev Biol, 2017, 422(2):125-134.

[7] Mazel T. Crosstalk of cell polarity signaling pathways[J]. Proto Plasma,2017,254(3):1241-1258.

[8] Etienne-Manneville S. Cdc42 - the centre of polarity[J]. J Cell Sci. 2004, 117(Pt8):1291-1300.

[9] Han Z, Motegi F. Reconstitution of self-organizing PAR polarity circuits[J].Mech Dev, 2017 ,145: 58.

[10]張文菲，李明偉，趙 澤，等.Cdc42 在小鼠磨牙牙胚發育過程中的表達[J].牙體牙髓牙周病學雜志，2016，26(10):598-601，638.

[11]Miletich I, Sharpe PT. Normal and abnormal dental development[J].Hum Mol Genet,2003,12(1): 69-73．

[12]Guo X, Stafford LJ, Bryan B， et al. A Rac/Cdc42-specific exchange fac tor, GEFT,induces cell proliferation, transformation, and migration[J].J Biol Chem,2003,278(15):13207-13215.

[13]Etienne-Manneville S, Hall A. Rho GTPases in cell biology[J].Nature, 2002,420(6916): 629-635.

[14]李明偉. 成牙本質細胞極性相關蛋白cdc42和E-cadherin的表達及功能[D].西安：第四軍醫大學,2014.

[15]Jo?o SM,Arana-Chavez VE. Tight junctions in differentiating ameloblasts and odontoblasts differentially express ZO-1, occludin,and claudin-1 in early odontogenesis of rat molars[J]. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol,2004, 277(2):338-343.

[16]Miletich I，Sharpe PT．Normal and abnormal dental development[J]． Hum Mol Genet，2003，12(1):R69-R73.