維甲酸對高氧環境下原代培養肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷的保護機制

潘琦琦 馬金帥 劉秀香 呂朦

[摘要] 目的 探討維甲酸（RA）對高氧環境下原代培養的肺泡Ⅱ型上皮細胞（AECⅡ）損傷的保護機制。 方法 分離、純化孕19 d的胎鼠肺組織，得到肺泡Ⅱ型上皮細胞進行細胞培養，待細胞生長至亞匯合（約占瓶底80%以上時）將細胞分為空氣組、高氧組、高氧+RA組，其中高氧+RA組加入含有10-6 mol/L的RA?？諝饨M置于空氣中培養;高氧組與高氧+RA組置于37℃、95% O2 - 5%CO2條件下培養24 h，用測氧儀檢測培養皿中的氧濃度。采用流式細胞術（AnnexinV-PI雙標記）檢測AECⅡ凋亡，Western blot檢測Wnt通路中β-catenin蛋白質的表達，PCR檢測β-catenin基因的表達。 結果 高氧組暴露24 h，AnnexinV （+）PI（-）和AnnexinV（+）PI（+）標記的AECⅡ數較空氣組及高氧+RA組均顯著升高（P < 0.01）;與空氣組比較，高氧組β-catenin蛋白質的表達顯著降低，差異有統計學意義（P < 0.01），與高氧組比較，高氧+RA組則上調高氧暴露β-catenin蛋白的表達（P < 0.01）。 結論 高氧環境下可導致AECⅡ大量凋亡、壞死;RA通過上調β-catenin蛋白的表達，降低AECⅡ壞死、凋亡，從而對高氧肺損傷起到保護作用。

[關鍵詞] 維甲酸;高氧;肺泡Ⅱ型上皮細胞;β-catenin蛋白

[中圖分類號] R563 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2018）12（c）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate protective mechanism of retinoic acid on primary cultured alveolar type Ⅱ epithelial cells under hyperoxia. Methods Alveolar type Ⅱ epithelial cells were isolated and purified from fetal rat lung tissue at 19 days of gestation. When the cells grew to the fused state （80% bottle bottom）， the cells were divided into air group， hyperoxia group and hyperoxygenation + RA group. The apoptosis of AECⅡ was detected by flow cytometry， the β-catenin protein expression of Wnt signal pathway was detected by Western blot， and the β-catenin gene expression was detected by PCR. Results Compared with the air group and the hyperoxygenation + RA group， the AECⅡ number of AnnexinV （+） PI （-） and AnnexinV （+） PI （+） markers in the hyperoxia group was significantly higher at 24 h of exposure （P < 0.01）， and the cell number was significantly reduced after RA addition. Compared with the air group， the expression of β-catenin protein of the hyperoxia group was significantly decreased， the difference was statistically significant （P < 0.01）， while compared with the high oxygen group， the expression of β-catenin protein of the hyperoxygenation + RA group was upregulated significantly （P < 0.01）. Conclusion Hyperaerobic environment can lead to massive apoptosis and necrosis of AECⅡ， and RA can reduce apoptosis of this cell by up-regulating the expression of β-catenin protein， thus playing a protective role in hyperoxic lung injury.

[Key words] Retinoic Acid; High oxygen; Type Ⅱ alveolar epithelial cell; β-catenin protein

肺泡上皮細胞包括Ⅰ型上皮細胞（alveolar epithelial type Ⅰ cells，AECⅠ）及Ⅱ型上皮細胞（alveolar epithelial type Ⅱ cells，AECⅡ）。AECⅠ主要進行氣體交換，AECⅡ主要分泌肺表面活性物質，且在高氧環境下AECⅡ具有分裂、增殖并分化為AECⅠ的潛能，故具有修復受損傷上皮的作用[1-3]。新生兒呼吸窘迫綜合征，又稱新生兒肺透明膜病，主要是由于缺乏肺泡表面活性物質所引起的呼吸困難。氧療是目前治療新生兒呼吸窘迫綜合征的主要措施[4]。但長期的氧療，特別是高氧環境下會影響水通道蛋白[5-6]及視網膜受體表達[7]，從而引起肺水腫及視力障礙等。如果我們在氧療中加入某種藥物減輕高氧導致的損傷，將能有效地提高一些新生兒、早產兒的生存率。95%高濃度氧是研究高氧肺損傷中常用的濃度[8]。

Wnt經典信號通路包括 Wnt 配體蛋白、細胞膜上的受體、細胞核內調控因子、細胞漿內的信號轉導部分等[9]。大量研究結果表明，此通路活化的關鍵是胞漿中是否存在穩定的β-catenin[10]。早期的研究證實，β-catenin可以表達于支氣管上皮細胞[11]，敲出β-catenin可導致小鼠胚胎發育停滯[12]，說明Wnt/β-catenin通路參與了胚胎發育及肺泡的形成。其中Wnt7b信號分子廣泛分布于AECⅡ表面，可與受體結合，抑制胞核內“破壞復合體”的解體，使得β-catenin 在胞內聚集引起下游靶基因的轉錄，調控組織的穩定、細胞分化、能量代謝、干細胞維持以及損傷修復等生物學效應[13-14]。維甲酸是維生素A在生物體內的重要活性形式，是調節細胞增殖及凋亡，是肺發育、修復的重要物質，可以預防早產兒的各種并發癥[15]。胎兒時期，氣管-支氣管細胞中的維生素A酶可以促進維生素A轉化成維甲酸（RA），存儲于ACEⅠ及AECⅡ中，調節細胞的生長、發育、轉化、凋亡[16]?？烧{控IGF受體的表達，進而修復損傷的肺組織。然而，RA是否能對高氧引起的肺損傷起保護作用及是否與Wnt信號通路相關尚不清楚，本研究以孕19 d的胎鼠為研究對象，探討了Wnt通路中的關鍵因子β-catenin的表達情況，并為臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級成熟健康SD大鼠[山東魯抗醫藥股份有限公司，動物合格證號：SCXK（魯）2013-0019]，雌鼠（230～260 g）12只，雄鼠（280～330 g）6只。于晚上19：00～20：00，以雌雄比例1∶1合籠，次日7：30～8：00查見陰栓或者行陰道涂片檢查，若在顯微鏡下看到精子，記為孕0 d，飼養至孕19 d進行AECⅡ的提取。DMEM培養基、胎牛血清（FBS）（美國Hyclone公司，生產批號：AD16191267）;Ⅳ型膠原酶（美國Sigma公司）、胰蛋白酶（美國Hyclone公司）、Hank′s平衡鹽溶液（上海碧云天生物技術有限公司，生產批號：20170107）、Ig G包被干粉（Sigma公司）;RNA提取、反轉定量試劑盒（TaKaRa公司，生產批號：20180112）;兔抗大鼠β-actin抗體（北京博奧森生物技術有限公司）;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔（北京中杉金橋技術有限公司）;細胞凋亡檢測試劑盒（凱基生物;生產批號：20170410）。

1.2 方法

1.2.1 AECⅡ原代培養 ?用4%水合氯醛腹腔內麻醉孕19 d的SD孕鼠。將孕鼠置于鼠臺，75%酒精消毒，剖開腹腔，取出含有孕鼠的子宮，盡量去除肺組織的氣管、支氣管及血管，剪碎肺組織至1 mm3，于預冷的Hank′s平衡鹽溶液中反復清洗，至液體清亮。用0.1%胰酶、0.1% Ⅳ型膠原酶消化肺組織至膠凍狀，FBS終止消化后，100目篩網過濾，經差速離心、差速貼壁和免疫黏附純化方法獲得AECⅡ。將提取的細胞置于37℃ 5% CO2-95% O2培養中培養。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖能力 ?將細胞接種在96孔板上，24 h待細胞生長至80%亞融合狀態時，將細胞分成對照組和不同濃度RA組（10-5、10-6、10-7、10-8 mol/L），每組設4個復孔，培養12、24、48 h后，加入含0.5/L MTT的培養基，每孔于酶標儀570 m波長處檢測每孔吸光度。分別計算出不同濃度RA作用下細胞的增值及活力情況。

1.2.3 實驗分組 ?原代AECⅡ生長至80%融合狀態時，進行細胞換液，并分為三組：空氣組、高氧組、高氧+RA組。其中高氧+RA組加入有終濃度為10- 6 mol/L的RA，余兩組不予特殊處理。高氧組與高氧+RA組置于37℃ 95%O2-5%CO2條件下培養24 h。其中高氧組在培養結束時均用CYS-1數字式測氧儀檢測培養皿中的氧濃度，氧濃度低于90%的樣品棄去。

1.2.4 流式細胞儀檢測AECⅡ細胞凋亡 ?培養細胞至24 h后分別取空氣組、高氧組、高氧+RA組各1瓶，用配制的0.1%的胰酶消化細胞，經離心、PBS洗細胞、AnnexinV-PI雙染色后進行進行流式細胞儀檢測。實驗重復3次。結果分析：左下象限代表正常細胞[AnnexinV（-）PI（-）]，左上象限代表細胞收集過程中出現的損傷細胞[（AnnexinV（-）PI（+）]，右下象限代表早期凋亡細胞[（AnnexinV（+）PI（-）]，右上象限代表晚期凋亡細胞和壞死細胞[（AnnexinV（+）PI（+）]。

1.2.5 Western blot檢測AECⅡ中β-catenin蛋白質的表達 ?首先按照蛋白提取試劑盒說明書提取細胞蛋白;其次測定蛋白濃度，根據所測定的蛋白濃度，取各組變性后的蛋白 60 μg上樣，經過跑膠、轉膜、封閉后，加入兔抗鼠β-catenin多克隆抗體，4℃孵育過夜。37℃復溫30 min、TBST洗膜3次后，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，最后發光底液曝光。用Image J軟件分析，計算β-catenin/β-actin比值，以分析蛋白表達情況。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測AECⅡ中β-catenin的mRNA含量 ?提取RNA，用酶標儀用酶標儀檢測波長為280 nm處和260 nm處的吸光值。OD260值為RNA濃度，OD260/OD280值為RNA的純度。引物的設計合成由生物工程（上海）股份有限公司提供，見表1。經提取RNA→溶解RNA→純度分析→反轉為cDNA→反轉錄→PCR反應：95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循環35次。以β-actin為內參基因，比較Ct法檢測各樣本的mRNA 表達情況，ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因，ΔΔCt =ΔCt實驗組-ΔCt對照組采用2-ΔΔCt法進行分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 倒置顯微鏡觀察AECⅡ形態變化

AECⅡ培養24 h，貼壁良好，細胞團呈島狀分布，可見明顯細胞核及核仁，折光性好。高氧組及高氧+RA組出現貼壁不牢，懸浮細胞增多，折光性下降，胞內可見明顯空泡。尤以高氧組明顯。見圖1

2.2 不同濃度RA對原代AECⅡ細胞的作用

MTT法確定RA濃度。經單因素方差分析示10-5～10-8 mol/LRA對細胞各點無明顯的抑制作用，在48 h，RA對細胞的增值作用顯著（P < 0.01）。其中，在24 h時，10-6 mol/L RA具有明顯的促增值作用;在48 h，促增值作用最大在10-7 mol/L。因此選擇10-6 mmol/L作為干預條件。見圖2。

2.3 流式細胞術檢測AECⅡ的凋亡

采用AnnexinV-PI雙染進行流式結果分析表明，高氧組暴露24 h，AnnexinV（+）PI（-）和AnnexinV（+）PI（+）標記的AECⅡ數高于空氣組及高氧+RA組（P < 0.05）。表明RA可明顯抑制高氧環境下AECⅡ凋亡。見圖3。

2.4 Western blot檢測各組AECⅡ中β-catenin蛋白的表達

結果顯示空氣組細胞內可檢測到β-catenin蛋白表達，三組AECⅡ中β-catenin蛋白的表達水平比較，差異有統計學意義（F = 115.44，P < 0.01），且與空氣組比較，高氧暴露組β-catenin蛋白表達水平明顯降低（P < 0.01），高氧+RA組與高氧組比較，β-catenin蛋白表達水平明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.01）。證明RA可促進高氧組ACEⅡ中β-catenin蛋白的表達。見圖4

2.5 PCR檢測AECⅡ中β-catenin mRNA的含量

結果顯示空氣組細胞內可檢測到β-catenin的mRNA表達，三組AECⅡ中β-catenin mRNA的含量比較，差異有統計學意義（F = 325，P < 0.01）;與空氣組比較，高氧組β-catenin mRNA水平明顯降低（P < 0.01），高氧+RA組與高氧組比較，β-catenin mRNA水平較高氧組有所升高（P < 0.05）。證明RA可促進高氧組 ACEⅡ中β-catenin mRNA的表達。見圖5。

與空氣組比較，*P < 0.01;與高氧組比較，#P < 0.05

3 討論

經典Wnt信號通路與肺發育關系最為密切，其對β-catenin濃度的調控處于中心位置[10]。而β-catenin的濃度受Axin/GSK-3/APC復合體的調控，當無Wnt配體存在時，胞質中的Axin復合體處于穩定狀態，復合體泛素化后被蛋白酶體降解，導致胞質中的β-catenin維持在較低濃度。相反，當Wnt配體激活后，Axin復合體解聚，胞漿內β-catenin不斷積累從而處于高濃度[17]。Wnt信號通路的激活在調控肺損傷修復中起關鍵性的作用[11-12]。

高氧可產生較多氧自由基，產生肺部炎癥，從而造成細胞凋亡。本實驗結果表明，與空氣組比較，高氧暴露下AnnexinV（+）PI（-）和AnnexinV（+）PI（+）標記的AECⅡ數明顯升高，而加入合適濃度的RA組，細胞凋亡數量少于高氧組，說明高氧可加快細胞凋亡，RA可對AECⅡ可起到保護作用。而RA對細胞起保護作用的機制尚不明確，本研究對細胞中的β-catenin的蛋白表達水平進行檢測，發現該蛋白可以在正常組表達，其適當的表達會促進肺細胞發育[18-20];在高氧組中蛋白表達明顯降低，而RA+高氧組的蛋白表達量介于其余兩組之間，表明RA可以通過調控該蛋白對高氧環境下AECⅡ起到抗氧化作用，而β-catenin信號分子是Wnt通路中的核心因子[10]，表明RA可能通過激活Wnt通路，引起β-catenin在細胞中積累升高，從而減少肺組織的損傷。同樣條件下，采用PCR技術檢測β-catenin的基因水平，高氧組β-catenin mRNA水平明顯降低，而RA+高氧組的基因表達高于高氧之間，進一步表明了RA可能通過Wnt通路拮抗高氧所致的肺損傷。

綜上所述，RA可對高氧引起的肺損傷起到保護作用，其機制可能與激活Wnt配體，上調β-catenin濃度相關。本實驗初步證實了RA的保護作用，為臨床應用RA預防高氧肺損傷奠定了一定的實驗基礎。

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（收稿日期：2018-07-16 ?本文編輯：任 ? 念）