肉牛妊娠初期血、尿中孕酮、妊娠相關糖蛋白、早孕因子的變化

金 海， 趙拴平， 徐 磊， 賈玉立， 賈玉堂*

(1.安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所，安徽 合肥 230031；2.安徽省潁上牛哥牧業科技有限公司，安徽 潁上 236200)

肉牛飼養中，配后未孕確診的時間越早，越有利于縮短配種間隔，減少空懷時間，提高牛群受胎率，降低飼養成本。而母牛體內相關生殖激素及水平能反映出自身妊娠狀態，比如孕激素，主要成分為孕酮(P4)，與雌激素共同調節雌性動物發情與妊娠，動物妊娠后P4一直維持在較高水平。妊娠相關糖蛋白(PAG)是反芻動物胎兒胎盤的滋養層雙核細胞在母體子宮上皮細胞融合時釋放的物質，檢測血液中PAG逐漸成為國際主流的牛早期妊娠診斷方法[1]。早孕因子(EPF)是由Morton等在小鼠受精6 h后的血清中首次發現，此后在妊娠豬、牛、羊等哺乳動物母體內均有發現，是確認妊娠的標志之一[2]。近年來，研究配后母體內激素含量變化是一種新穎、前沿的早期妊娠診斷技術，奶牛[3]、牦牛[4]、水牛[5]、羊[6]、熊貓[7]、獼猴[8]等動物上均有報道，但目前仍處于研究階段，未見成熟上市產品及推廣。激素的種類及判定標準也在不斷完善和豐富。

試驗通過酶聯免疫檢測(ELISA)試劑盒檢測肉牛配種后的不同天數中，血液、尿液中P4、PAG和EPF濃度變化，用于對比母牛妊娠與非妊娠、血液與尿液中的差異，為今后尿液作為早期妊娠診斷媒介的可能性提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗樣本選擇及分組

選擇潁上牛哥牧業科技有限公司大別山資源場內的安—大雜交牛F1代(安格斯♂×大別山♀)作為試驗牛，隨機選擇膘情適中，繁殖機能正常，發情明顯的F1代7頭。圈養在同一欄(欄面積約80 cm2)，一天兩餐，飲水充足，每天清掃1次欄舍。每頭牛喂青貯飼料20～30 kg/d，精料2～3 kg/d。

爬跨或接受爬跨，且陰道有粘液流出的母牛視為發情。7頭試驗牛發情表現均明顯，其中5頭配種后均未返情，視為懷孕(試驗組);另外2頭在配種后21 d返情，視為未孕(對照組)。

1.2 采樣及樣品處理

牛發情并配種的當天記為第0天，在第0、1、8、17、21、28、35 天(共7次)分別采集血、尿液各5 mL。綁定架固定好牛后，采用紅頭真空采血管(不添加任何添加劑)頸靜脈采血，等牛排尿時，直接用10 mL離心管收集尿液。

采集的血液4 ℃靜置1 h，離心機3 000 r/min離心30 min，收集血清，分裝標號。處理后的血樣、尿樣-20 ℃冷凍保存。

1.3 激素檢測

用ELISA試劑盒檢測試驗組與對照組在不同時間內血、尿中激素(P4、PAG、EPF)的含量變化，ELISA試劑盒購買于江蘇酶標生物科技有限公司。按照試劑盒說明書操作。

1.4 數據統計分析

采用SPSS Statistics 17.0統計軟件處理數據，采用單因素方差分析，LSD法進行多重比較。以P<0.05為差異顯著，0.05

2 結果與分析

2.1 妊娠初期血、尿中孕酮(P4)濃度變化

由表1可知，0～35 d，試驗組與對照組血、尿液中P4濃度無明顯變化。同一組別中，血液濃度高于尿液的。同一樣品中，試驗組濃度高于對照組。試驗組血液中P4含量與對照組在第0/17/21/35天差異顯著(P<0.05)，在第8天差異極顯著(P<0.01)。試驗組尿液中P4含量與對照組在第1天，差異顯著(P<0.05)，在第5天差異極顯著(P<0.01)。

2.2 妊娠初期血、尿中妊娠相關糖蛋白(PAG)濃度變化

由表2可知，0～35 d，試驗組與對照組血、尿液中PAG濃度變化平穩。同一樣品中，對照組濃度高于試驗組。同一組別中，血液中的濃度高于尿液。試驗組與對照組血、尿液中，PAG濃度均先升高后下降。血液中，第8～17天濃度較高，隨后下降。尿液中，第8天達到小高峰，隨后濃度下降，第28天后又逐漸上升。血液中PAG濃度，對照組與試驗組在第8/21天差異顯著(P<0.05)，第28天極顯著(P<0.01)；尿液中PAG濃度，對照組與試驗組在第21/28天差異顯著(P<0.05)。

表1 妊娠初期血液與尿液中P4檢測結果 pmol/L

注：*表示對照組與試驗組差異顯著(P<0.05)；**表示對照組與試驗組差異極顯著(P<0.01)。下同。

表2 妊娠初期血液與尿液中PAG檢測結果 ng/L

2.3 妊娠初期血、尿中早孕因子(EPF)濃度

由表3可知，母牛配后0～35 d里，血液、尿液中EPF濃度變化平穩。但試驗組濃度高于對照組，血液中的高于尿液。比較同一天里的試驗組與對照組濃度差異可知，血液中試驗組與對照組濃度差異值較大，在第8/17/21天，有顯著差異(P<0.05)。尿液則濃度差異值較小，在第28天，有顯著差異(P<0.05)。

表3 妊娠初期血液與尿液中牛EPF檢測結果 ng/L

4 討 論

4.1 P4作為牛妊娠診斷的依據

理論上認為，母牛在發情至配后第5天前，P4濃度較低且無明顯升高，自此之后明顯增長，直到第16天左右，體內P4會逐漸增加，若妊娠，則維持在較高水平，安宮保胎。有研究表明，湘西黃牛發情當天血液中P4濃度(0.36 ng/mL)較低，第12天達到峰值(14.85 ng/mL)[9]。草原紅牛、延邊黃牛、西門塔爾在發情當天和配種后1 d內，血清中P4含量(約1 ng/mL左右)很低，第8天含量升高，直至第17天，孕牛與非孕牛P4含量出現顯著性差異，孕牛持續維持在較高水平，非孕牛則開始下降。3個品種配后第21天的P4含量，以孕牛均高于未孕牛，差異極顯著[10]。而本次試驗中，無論是試驗組與對照組，還是血液與尿液中，整個妊娠初期P4均沒有出現明顯的高低濃度波動，甚至血液試驗組在第8～21天含量呈下降趨勢。具體原因有待進一步研究。

4.2 PAG作為牛妊娠診斷的依據

PAG是反芻動物胎盤滋養層細胞分泌產生的一類特異性糖蛋白，是反芻動物獨有的糖蛋白[11]。Zoli等[12]利用放射免疫技術(RIA)測定妊娠母牛血液中PAG濃度變化，結果發現PAG濃度在妊娠20～240 d持續增長，產后PAG濃度逐漸降低。近年來，牛PAG研究主要集中在配種26 d以后，其原因在于胎盤糖蛋白在妊娠診斷中的應用只有在懷孕后26～30 d才能產生高敏感性和特異性[13]?？赡墁F有的檢測技術精確度仍有所欠缺，在低濃度條件下，敏感性、穩定性、可重復性不夠，難以發現和總結母牛配后26 d前的PAG規律性變化。本試驗檢測配后0/1/8/17/21/18/35 d的PAG濃度，是為了研究配后0～35 d PAG濃度合理變化規律，雖然對照組與試驗組濃度有差異，但變化趨勢相似，即妊娠與未妊娠母牛PAG變化相似，與理論規律有所出入，這尚需進一步考證。

4.3 EPF作為牛妊娠診斷的依據

EPF優勢在于無種屬差異[14]，制備檢測試劑盒的材料來源廣。有研究表明，奶牛受精24 h后，血清和乳中可檢測到EPF，妊娠終止，則會在48 h內消失[15]。也就是說，體內EPF的存在可以作為妊娠的標志物，也可以作為早期妊娠診斷的重要指標[16]，但目前圍繞EPF開展的早期妊娠診斷研究報道較少。本次試驗中，試驗組濃度高于對照組，且血液中差異更為明顯，在第8天就有明顯差異(P<0.05)，而尿液中需要到第28天才有明顯差異(P<0.05)，說明相同條件下，懷孕母牛的EPF濃度高于未孕的，且通過血液檢測EPF診斷是否妊娠，差異更顯著，效果更好。

4.4 牛早期妊娠診斷現狀及展望

反芻動物中，奶牛早期妊娠診斷的研究較多。常見的診斷方法有直腸檢查、超聲波B超檢查等臨床診斷和監測激素變化的實驗室診斷[17]。臨床診斷方法對操作技術、檢測設備要求高，過程繁瑣，熟練的從業者最早只能在配后第35天確診牛的妊娠;此外，觸診可能會導致胚胎或胎兒意外死亡[18]。實驗室診斷則相對簡單和安全，最初采用放射免疫方法檢測早期妊娠母牛體內激素變化，但昂貴的檢測設備和輻射危害，限制了實際生產中的使用和推廣。近年來，隨著酶聯免疫吸附技術(ELISA)的快速發展，其更為簡潔、方便、快速的操作，在早期妊娠診斷領域里也有了更多的使用和研究。被診斷的動物從常見的奶牛，推廣到黃牛、羊、猴、大熊貓、黑熊等不同物種上。

檢測樣品呈現多元化，包括乳汁、血液、尿液、陰道粘液、糞等。其中，筆者認為，尿液是反映機體激素變化一種良好的媒介。優勢在于，采集方便，不僅是在體內激素變化的輔助診斷上具有重要價值[19]，而且適用于所有種屬動物，可以做到真正的無創[20]。對于肉牛來說，采集奶樣不方便，采血應激大，散養牛群綁定、固定操作難度大。以尿液作為妊娠診斷參考的研究也見于報道，蔡正華等[21]將妊娠母豬尿中雌酮水平作為妊娠診斷的依據，王宏娟等[10]用放免方法檢測孕牛尿液中生殖激素的變化規律，K.L. Evans等[22]用尿雌酮共軛分析法診斷馬的妊娠，J.Volkery等[23]試驗結論得出，妊娠羊駝尿中孕酮含量顯著高于非妊娠的，適合作為妊娠診斷的標準。

激素檢測方法上，主要分為放射免疫測定法(RIA)和酶聯免疫測定法(ELISA)，后者簡單快速，更適合于實際生產。大部分早期妊娠診斷研究采用RIA，此方法對檢測設備的要求高，有輻射，使用范圍受限，不適合集約化、規?；B殖場自行使用。自2010年后，ELISA試劑盒檢測激素變化的研究報道有所增加，A. Karen等[24]檢測孕牛血清PAG的濃度變化，以配種后第28天直腸檢測結果為標準，驗證了RIA法與ELISA法的檢測結果無差異，證明了ELISA檢測的可靠性和可行性。

綜上所述，肉牛的早期妊娠診斷研究少，且現有研究主要是通過血液中激素變化診斷鑒定，檢測手段主要是RIA。因此，本試驗探討的3個問題，對于肉牛的早期妊娠，第一，體內的妊娠相關激素(P4、PAG、EPF)變化規律；第二，血液，尤其是尿液中的激素變化；第三，國產ELISA試劑盒檢測效果。為肉牛以尿液為檢測媒介的早期妊娠診斷研究提供了基礎工作依據。

5 結 論

肉牛母體內P4、PAG、EPF濃度，血液中高于尿液中。通過ELISA檢測肉牛血液中EPF，能在配后第8天診斷母牛妊娠狀態。