槲皮素對缺氧人肝癌細胞HepG2增殖及HIF-1α、VEGF的影響

韋 艷，陸艷玲，王榮榮，馮勝進，梁 鋼

肝細胞癌是嚴重影響人類生命健康的惡性腫瘤之一。肝癌細胞的快速增殖及耗氧量使細胞處于低氧的微環境中，低氧環境所啟動的低氧誘導因子HIF-1α是重要的核轉錄因子，能調控涉及腫瘤增殖和轉移、血管生成、能量代謝等相關下游基因的轉錄和翻譯[1，2]。血管表皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是HIF-1α重要的靶基因之一，是促進腫瘤血管生長的重要因子，目前，研究以HIF-1α /VEGF信號通路為靶點的抗腫瘤藥物已成為熱點，槲皮素是一種廣泛存在于自然界的黃酮類化合物，已有大量的體內外研究證實槲皮素可通過多種機制抑制腫瘤細胞增殖、誘導分化、促進凋亡發揮其抗腫瘤活性[3-5]，本實驗通過模擬低氧環境，測定槲皮素對肝癌細胞HepG2增殖能力、HIF-1α以及VEGF表達的影響，探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞HepG2保種于廣西醫科大學實驗中心，槲皮素(純度>99%)購自成都曼思特生物科技有限公司，胰蛋白酶購自美國Hyclone 公司,胎牛血清購自杭州四季青公司, 四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)均購自美國Sigma 公司；兔抗人多克隆抗體HIF-1α、VEGF為Santa Cruz產品，總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技公司，反轉錄試劑盒和Real-time PCR 試劑盒購自大連TaKaRa 公司,PCR 引物由上海生工公司合成，實時定量熒光PCR 檢測儀為美國Applied Biosystems公司,酶標儀為美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HepG2于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養液中,37 ℃,5%CO2培養, 相差倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，0.25%胰酶消化傳代,取對數生長期細胞用于實驗。采用化學缺氧誘導劑CoCI2模擬缺氧微環境，加入培養液的終濃度為150 μmoI/L。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖能力 分組：正常對照組，缺氧組(化學缺氧劑CoCl2加入培養液的終濃度為150 μmol/L,模擬低氧微環境)，缺氧+槲皮素組 (槲皮素為37.8 μmol/L，該槲皮素的濃度為48 h對細胞10%抑制率濃度)取對數生長期的HepG2細胞懸液以1×105個/ML的濃度接種于96孔培養

板,每孔100 μl，培養12 h，加入作用藥物，每孔終體積200 μl，再分別培養12、24、48、72 h，終止培養后每孔加入5 mg/ml MTT 20 μL，繼續培養4 h，棄培養液，每孔加入DMSO 150 μl震蕩15 min，酶標儀測定波長492 nm處光密度值，實驗不同日重復3次。

1.2.3 Real-time PCR檢測HIF-1α、VEGF mRNA表達 實驗分組同MTT法，各組細胞均培養48 h。按trizol說明書提取細胞總RNA，測定RNA純度及濃度，反轉錄試劑盒合成cDNA。引物序列：β-actin正義引物5′-GCATGTACGACAGAGCCGTACGC-3′, 反義引物5′TCAACGCAGACATATCCAGC-3′長度為263 bp,HIF-1α 正義引物5′-CAGTACACACAGCGTACGC-3′長度為175 bp,反義引物5′TCAAGCCAGACATATGCACC-3′。VEGF正義引物5′-TGAC-TTGACTCGAGTCCTG-3′, 反義引物5′-TACGTCCT-AGCCGAGATCG-3′長度為206 bp,運用ABI PRISM7900 PCR儀進行擴增。反應程序: 條件為95 ℃ 2 min(1個循環),90 ℃ 20 s,55 ℃ 30 s,68 ℃ 50 s(40個循環),采用2-ΔΔCt法計算檢測基因mRNA 的相對表達量，實驗不同日重復3次。

1.2.4 Western Blot檢測HIF-1α、VEGF蛋白表達 實驗分組同MTT法，各組細胞均培養48 h。蛋白裂解液提取各組細胞總蛋白，bradford法測定蛋白質濃度。定量后進行SDS-PAGE垂直電泳，濕法PVDF轉膜，5%脫脂牛奶封閉過夜，4 ℃與一抗稀釋液(1∶200)孵育過夜，TBST清洗3次，與二抗稀釋液孵育2 h, ECL發光，顯影，掃描后應用quanity-one軟件進行分析。

1.2.5 統計學處理 應用SPSS 16.0 軟件進行統計分析，采用方差分析,多組資料兩兩比較采用LSD-t 多重檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MTT法檢測細胞增殖能力 各組細胞光密度值如表1，各組細胞增殖能力如圖1，在12 h時，各組細胞光密度值差異無統計學意義，即各組細胞在12 h增殖能力無差異。在24、48、72 h，各組細胞光密度值差異均有統計學意義(P<0.05),缺氧組細胞增殖能力較正常對照組降低，與缺氧組比較，缺氧+槲皮素組在24、48、72 h細胞增殖能力降低。

時間(h)正常對照組缺氧組缺氧+槲皮素組F120.369±0.0120.354±0.0130.351±0.0240.903240.640±0.0160.551±0.021①0.435±0.023②78.354481.287±0.0250.851±0.028①0.717±0.013②494.601721.738±0.0271.268±0.018①0.984±0.037②535.436

注：與正常對照組比較, ①P<0.05, 與缺氧組比較, ②P<0.05

圖1 各組細胞增殖能力的比較

2.2 各組細胞HIF-1α、VEGF mRNA表達 與正常組比較,HepG2細胞在低氧狀態下HIF-1α、VEGF mRNA表達上調(P<0 05)，槲皮素作用后VEGF mRNA表達下調(P<0 05)，對HIF-1α mRNA表達無影響，各組基因相對表達量見表2。

基因正常對照組缺氧組缺氧+槲皮素組HIF-1α1.000±0.0002.298±0.031①2.326±0.027②VEGF1.000±0.0002.065±0.090①0.990±0.077③

注：與正常組比較，①P<0.05；與缺氧組比較，②P>0.05；與缺氧組比較，③P<0.05

2.3 Western Blot檢測HIF-1α、VEGF蛋白表達 各組細胞HIF-1α 、VEGF蛋白相對表達量見表3，蛋白表達區帶見圖2。在低氧狀態下HepG2細胞HIF-1α 、VEGF 蛋白表達上調(P<0.05)，槲皮素作用后對低氧細胞中HIF-1α蛋白表達無影響，而下調VEGF 蛋白表達(P<0.05)。

蛋白正常對照組缺氧組缺氧+槲皮素組HIF-1α0.616±0.0161.385±0.047①1.406±0.029②VEGF0.831±0.0342.022±0.076①1.137±0.054③

注：與正常組比較，①P<0.05；與缺氧組比較，②P>0.05；與缺氧組比較，③P<0.05

圖2 各組細胞HIF-1α 、VEGF蛋白表達區帶

3 討 論

HIF-1α是低氧誘導因子家族中受到氧濃度調節的主要因子，在缺氧情況下，HIF-1α的泛素-蛋白酶體降解途徑被阻斷導致其在細胞內蓄積，從而啟動下游因子的轉錄與翻譯。VEGF是受HIF-1α調控的下游因子之一，HIF-1α與VEGF的缺氧反應元件結合后啟動其轉錄與翻譯，使其相關產物表達增加。VEGF作為血管生長重要的誘導因子之一，對促進細胞增殖，抑制細胞凋亡等作用具有重要意義。CoCl2是較常用的低氧模型誘導劑，該實驗通過CoCl2誘導建立肝癌細胞HepG2缺氧的微環境，HepG2細胞在CoCl2誘導下， HIF-1α與VEGF表達均上調，達到了建立缺氧模型的目的。

在常氧環境下,槲皮素通過多種機制對肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲具有抑制作用[6,7]，但是在缺氧環境中槲皮素對肝癌細胞影響的研究較少。本實驗結果表明，在低氧環境中，槲皮素可抑制肝癌HepG2細胞的增殖，并且降低細胞中高表達的VEGF。肝癌細胞的生長、浸潤和轉移依賴于其腫瘤血管生成，許多實驗研究都呈現了VEGF 在肝癌組織及細胞中高表達的情形。VEGF 能通過旁分泌形式特異性作用于血管內皮細胞，通過增加血管通透性，使血漿蛋白外滲并與其他蛋白結合形成纖維網絡，最終形成血管化的結締組織，并且作為內皮細胞特異性的有絲分裂原，通過與內皮細胞膜上Flt1和Flk1/KDR兩個特異性受體結合，直接刺激內皮細胞分裂增殖，誘導新血管生成[8]。目前已有研究表明，槲皮素可通過調控VEGF的表達抑制腫瘤細胞的生長，有研究者通過MTT及Transwell 小室模型實驗發現槲皮素體外可抑制腎癌細胞ACHN的增殖和侵襲能力，并且可下調VEGF蛋白的表達，從而推測槲皮素對VEGF蛋白表達的影響可能是其抑制ACHN增殖的機制[9]。在體外槲皮素還能抑制白血病細胞NB4生長并誘導其凋亡，同時可抑制白血病細胞分泌VEGF[10]。因此槲皮素通過下調VEGF表達抑制腫瘤血管生長可能成為其抗腫瘤的新通道。實驗結果還顯示槲皮素在低氧環境下對HIF-1α基因與蛋白的表達差異無統計學意義，可能在低氧環境下槲皮素對肝癌細胞中高表達的HIF-1α無調控作用。首先，槲皮素對低氧環境中肝癌細胞增殖的抑制作用可能是通過降低VEGF的表達實現的，而與HIF-1α表達無關,槲皮素可能沒有通過HIF-1α /VEGF信號通路調節VEGF的表達。其次，除了HIF-1α之外，VEGF還可受多個上游基因的調控，如環氧化酶(COX-2),蛋白激酶B(AktB)，內皮抑素(ES)等[11-13]，槲皮素可能通過其他信號通路間接影響了VEGF的表達。最后，本次實驗采用的槲皮素作用濃度為細胞10%抑制率濃度，可能該濃度還未足以刺激細胞中HIF-1α達到轉錄及翻譯的水平改變，致使低氧細胞中下HIF-1α mRNA 及蛋白表達無差異。

總之，本實驗研究觀察到了槲皮素體外低氧環境中對人肝癌細胞HepG2增殖力的抑制作用，并且下調VEGF的表達，可能是槲皮素抑制腫瘤細胞生長的又一個機制。

[1] Semenza G.Signal transduction to hypoxia-inducible factor1 [J].Biochemical pharmacology ，2002，64(8)：993-998.

[2] Ellis L，Hammers H，Pili R.Targeting tumor angiogenesis with histone deacetylase inhibitors [J].Cancer Lett，2009，280(2)：145-153.

[3] Ma L，Feugang J M，Konarske P，etal.Growth inhibitory effects of quercetin on bladder cancer cell [J].Front Biosci，2006，11(9)：2275-2285.

[4] Bishayee K，Ghosh S，Mukherjee A，etal.Quercetin induces cytochromec release and ROS accumulation to promote apoptosis and arrest the cesscycle in G2/M，in cervical carcinoma:signal cascadeand drug-DNA in- teraction[J].Cell Profif ，2013，46(2)：153-163.

[5] Borska S，Chmielewska M，Wysocka T，etal.In vitro effect of quercetin on human gastric carcinoma：Targeting cancer cells death and MDR[J].Food Chem Toxicol，2012，50(9)：3375-3383.

[6] 劉 鋒，李 剛，胡明道，等.槲皮素對人肝癌高轉移細胞生長及侵襲能力的影響[J].昆明醫科大學學報，2014，35(5)：29-32.

[7] 史桂蘭，黃 琳,卿海燕，等.槲皮素對人肝癌SMMC-7721 細胞生長抑制及誘導凋亡作用[J].中國實驗診斷學，2015,19(1)：17-19.

[8] Hicklin D J,Ellis L M.Role of the vascular endothelial growth factor pathway in tumor growth and angiogenesis [J] .J Clin Onco，2005，23(5)：1011-1027.

[9] 范宗榮，張志強，于德新,等.槲皮素對人腎癌細胞株細胞增殖、侵襲及其VEGF表達的影響[J].安徽醫科大學學報，2012，47(8):887-889.

[10] 鐘 璐，陳芳源，王 海，等.槲皮素在體外對NB4細胞形態及VEGF分泌的影響[J] .中華腫瘤雜志,2006，28(1)：25-27.

[11] Shi X Y，Xi L，Weng D H，etal.Clinicopathological Significance of VEGF-C,VEGFR-3 and Cyclooxygenase-2 in Early-Stage Cervical Cancer[J].International Journal of Biomedical Science，2008，4(1)：58-63.

[12] Zhang H，Fagan D H，Zeng X，etal.Inhibition of cancer cell proliferation and metastasisbyinsulinreceptor down regulation[J].Oncogene，2010，29(17)：2517-2527.

[13] Huszthy P C，Brekken C，Pedersen T B，etal.Antitumor efficacy improved by local delivery of species-specific endostatin[J] .Neurosurg，2006，104(1)：118-128.