氧化鋯表面紫外線處理對成骨細胞生物學行為的影響

侯小青　侯玉東　孫鑫　孫龍

隨著種植體材料的創新與美觀要求的提高，以及最常用鈦及鈦合金種植體存在的先天缺陷，如在前牙區唇側骨量較少的患者會透出灰色的顏色影響美觀，以及鈦粒子釋放、菌斑聚集較多等不足[1-2]，并且在頭頸部進行磁共振檢查時，鈦種植體可形成局部透射偽影造成局部影像不清晰[3]；口腔全瓷種植體強度高、韌性高、具有牙齒顏色的氧化鋯材料成為制作口腔種植體的備選材料[4]。紫外線表面處理技術不需要附加或增加化學的方法改變種植體的表面形貌，是一種相對簡單干凈的技術，具有良好運用前景； 研究表明[5]，紫外線照射鈦表面可使其產生超親水性表面、使表面能增大、接觸角變小、有利于骨結合、增加種植體成功率。噴砂技術是表面粗糙的常用方法之一，同樣具有成本低、加工方法簡單、不需高溫條件等特點。本實驗通過紫外線照射不同粗糙度的氧化鋯表面，觀察其對MC3T3-E1生物學行為的影響，為促進氧化鋯種植體早期骨結合提供理論參考。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1細胞小鼠胚胎成骨細胞前體細胞 MC3T3-E1(中科院上海細胞庫)。

1.1.2主要試劑及儀器氧化鋯片(直徑12 mm，厚度3 mm，成都海利華生物科技有限公司)； α-MEM培養基、 胎牛血清(Hyclone，美國)； MTT(北京索萊寶科技有限公司)； 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；茜素紅(上海源葉生物科技有限公司)；酶標定量測試儀(Multiskan MS-352，雷勃， 芬蘭)；總RNA抽提試劑(Trizol)(Invitrogen，美國)； 反轉錄反應試劑盒、 實時定量熒光PCR試劑盒(SYBR Primix Ex TaqTM，Takara，日本)；熒光實時定量PCR儀(Rotor Gene 3000，Corbett，澳大利亞)。

1.2　實驗方法

1.2.1細胞培養將MC3T3-E1培養于含10% FBS的α-MEM培養基中，放置于37 ℃含5%的CO2培養箱中培養，3 d/次換液，細胞長至80%左右時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代種板。

1.2.2氧化鋯試件處理將氧化鋯片機械打磨后噴砂處理，各取一半用15 W UVC滅菌燈距離試件表面2 cm照射48 h，滅菌燈波長(250±20) nm。所有試件用75%酒精和蒸餾水清洗后，利用超聲清洗30 min后自然烘干備用。

1.2.3實驗分組實驗分4 組(n=3)，光滑對照組(S組)、光滑處理組(S-UV組)、粗糙對照組(R組)和粗糙處理組(R-UV組)，將4 組氧化鋯片置于含10%FBS的α-MEM培養基的24 孔板內，將MC3T3-E1接種于板內培養。

1.2.4MTT法檢測成骨細胞在氧化鋯表面的增殖取細胞計數約3×104個/ml細胞懸液接種至含4 組氧化鋯片的24 孔板內，每組設3 個復孔， 3 d換液1 次，于37 ℃ 5% CO2細胞培養箱中培養3、 5 d取出，吸去培養液，PBS輕柔清洗3 次，每孔加200 μl 5 mg/ml的MTT、 800 μl α-MEM， 37 ℃孵育4 h后小心吸去上清液，每孔加入1 ml DMSO生成紫色結晶物，放置于搖床10 min，每孔分別取3 份200 μl溶解液至96 孔板，空白孔調零，測定490 nm波長各孔的吸光度值。

1.2.5ALP活性測定取細胞計數約3×104個/ml細胞懸液接種至含四組氧化鋯片的24 孔板內，每組設3 個復孔，待細胞貼壁后換成骨誘導液，3 d換液1 次。 培養3、 7 d后，吸去培養液，PBS輕柔清洗3 次，每孔加入1 ml裂解液(0.5% Triton X-100)反復吹打，置37 ℃過液，按試劑盒上的說明操作，測定405 nm波長每孔的吸光度值。

1.2.6茜素紅染色定量測定鈣結節形成細胞按上述方法培養，培養21 d后吸去培養液，用PBS輕柔清洗3 次，每孔加95%的乙醇溶液固定10 min，去離子水漂洗2 次，接著用40 mmol/L茜素紅溶液(用氨水調至pH4.2)在37 ℃下染色10 min，用去離子水漂洗3 次，晾干，在倒置相差顯微鏡下觀察和攝片。加入10%氯化十六烷基吡啶，室溫放置30 min，將AR析出，從每孔取出100 μl溶液加入96 孔板，測定562 nm波長每孔的吸光度值。

1.2.7RT-PCR檢測成骨細胞成骨相關蛋白骨鈣素(OCN)、護骨素(OPG)mRNA的表達細胞按上述方法處理，培養7、 14 d后吸去培養液，PBS清洗3 次，用Triton提取總RNA，按反轉錄試劑盒上的實驗步驟合成cDNA。引物由上海生工生物工程公司合成。實時定量PCR反應體系采用Takara公司SYBR Premix Ex TaqTM20 μl體系。將各時間點光滑對照組的基因表達量定義為1，計算每組的相對表達量。

1.3　統計學分析

2　結　果

2.1　成骨細胞在氧化鋯表面增殖情況

數據顯示，實驗組與對照組的MC3T3-E1細胞隨時間變化，均呈上升趨勢。 3 d時粗糙組細胞增殖高于光滑組，在5 d時粗糙處理組細胞的增殖數量明顯大于其它各組(P<0.05, 圖 1)，光滑處理組與粗糙對照組無明顯差異。

圖 1MC3T3-E1細胞的增殖情況

Fig 1Proliferation of MC3T3-E1 cells

2.2　ALP活性測定情況

隨著時間增長，對照組與處理組ALP活性均為升高趨勢(圖 2)。 在7 d時粗糙處理組ALP活性均高于光滑組(P<0.05)，粗糙組間活性無明顯差異。

2.3　茜素紅染色測定鈣結節形成情況

在21 d時處理組鈣結節吸光度值高于對照組，粗糙組稍高于光滑組；粗糙處理組與對照組差異更為明顯(P<0.05， 圖 3)。

2.4　不同處理方法對成骨細胞OCN、OPG mRNA表達的影響

實驗組OPG、OCN mRNA的表達均隨時間上調明顯(P<0.05)。 第7 天時， 處理組OPG、OCN mRNA的表達高于對照組，粗糙組表達高于光滑組； 第14 天， 2 組基因的表達差異更為明顯，粗糙處理表達量明顯高于其它各組(P<0.05)， 光滑處理組與粗糙對照組無明顯差異。

圖 2MC3T3-E1細胞的堿性磷酸酶活性

Fig 2Alkaline phosphatase activity of MC3T3-E1 cells

圖 3細胞鈣結節染色吸光度值

Fig 3Absorbency of the stained calcium nodus

3　討　論

評價骨內段種植體的早期穩定性往往采用骨結合率等指標。種植體周圍成骨細胞活性及生物學性能對種植體骨周圍界面的形成起到關鍵的作用，而對種植體骨結合及生物活性的影響主要在于材料表面形貌及其化學組成[6]， 并且不同材料表面的不同改性方法可獲得不同的表面形貌和粗糙度，這將導致成骨細胞在種植體材料的表面所表現出的反應不同。氧化鋯擁有優秀的生物相容性和近乎完美的美學效果， 其彎曲強度為900～1 200 MPa， 壓縮強度可高達2 000 MPa[5]，完全可承受后牙的咀嚼力。在植入口內后不會受到唾液齦溝液的腐蝕，并可以減少菌斑的聚集從而減少種植體周圍炎的發生[7]。Ko 等[8]研究，氧化鋯與鈦有相似的細胞附著形態。Depprich 等[9]研究顯示氧化鋯材料細胞附著和生長率高于鈦。氧化鋯種植體表面改性的方法為通過酸蝕噴砂等物理的方法獲得最適合的微米級別的表面粗糙度，或者在種植體表面添加生物活性材料等[10]。粗糙的表面增大了種植體表面積，合適的粗糙度可促進細胞的早期附著，達到種植體早期穩定，提高種植體遠期成功率[11]。紫外線照射鈦種植體表面可增加其表面親水性，當照射由于長時間儲存而老化的種植體后，重新獲得表面活性并獲得親水性，促進成骨細胞粘附、增殖、分化、礦化和蛋白表達以及骨結合[12-14]。本實驗將噴砂及紫外線照射2 種表面改性技術相結合應用于氧化鋯，以期提高氧化鋯表面的生物活性，增加骨結合。

圖 4MC3T3-E1細胞中OPG、 OCN的mRNA表達

Fig 4The mRNA expression of OPG and OCN in MC3T3-E1 cells

MTT結果顯示，經紫外線照射的氧化鋯試件比未經照射的試件更能有效的促進成骨細胞的增殖，且紫外線噴砂處理組的增殖效果更佳，明顯優于其余各組。茜素紅染色結果提示，紫外線處理組的礦化程度要優于未處理組，且紫外噴砂處理組的礦化程度相對較高。因此，經紫外線照射后的試件能增加MC3T3-E1細胞的增殖與礦化，且噴砂粗糙組的效果更為顯著。ALP數據顯示，粗糙各組的活性高于光滑各組，且R組與R-UV之間無明顯差異，表明粗糙因素較紫外線因素對ALP活性的影響更為明顯。骨鈣素(OCN)是成骨細胞合成分泌的一種重要的非膠原蛋白，能夠與鈣結合，從而參與調節羥基磷灰石結晶生長，是反映成骨細胞分化成熟的指標[15-16]。護骨素(OPG)是TNF受體超家族成員，研究證實[17]，OPG/RANKL/RANK系統是破骨細胞分化成熟的主要調節機制，抑制破骨細胞分化和骨吸收功能。RT-PCR數據顯示，UV組OCN、OPG mRNA表達隨時間變化均表現為上調，雖然單純噴砂組(R組)的表達量較低于光滑紫外處理組(S-UV組)，但噴砂紫外處理組(R-UV組)的表達量相較于其他組OCN、OPG mRNA表達上調更為顯著。本實驗結果表明，噴砂處理的氧化鋯試件表面經紫外線照射可使MC3T3-E1細胞的增殖與礦化明顯增加，且OCN、OPG mRNA表達明顯上調，故粗糙紫外線處理氧化鋯試件可促進成骨細胞生物學功能，提高種植體早期骨結合。

雖然目前氧化鋯材料在口腔領域內的應用很廣泛，但氧化鋯材料轉化為種植體還需進一步研究，應在材料的機械性能、加工制作、表面處理技術及設計、臨床可靠性等做深入研究。

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