一種經皮種植體抗菌肽控釋涂層的構建及性能研究

苗強 夏雨凝 蒙萌 張征宇 馬楚凡

經皮鈦種植體在臨床上應用廣泛，如骨錨式助聽器、牙科植入物、頜面贗復體、心室輔助裝置等等，但由于皮膚結構和組成特殊性，如皮脂腺和毛囊的存在，同時體表為有菌環境，使經皮種植體在皮膚整合過程中有著遠高于口內種植體的感染率與失敗率［1－2］。

為了解決經皮種植體感染率高的問題，許多學者嘗試改變植入物的表面形貌、增大表面積從而增強植入物與經皮部位的整合，維持表皮屏障，以減少細菌的侵入、定植，降低感染風險［3－4］。

研究表明，微米級表面可以在植入物與皮膚結合處形成機械鎖扣結構，阻止上皮下行，從而促進皮膚整合［3］；而納米管結構有助于植入物與皮膚的整合，而且可以裝載藥物，納米管結構本身也有一定的抗菌性能［5］。但是，增大植入物表面積的同時也增加了病原體粘附幾率，不利于感染控制。因此即使經過嚴格的消毒與感染控制，經皮種植手術之后細菌侵襲仍然常有發生，經皮部位感染主要由金黃色葡萄球菌，凝固酶陰性葡萄球菌引起［6－7］，且種植體經皮部位在愈合過程中處于有菌狀態，因此僅僅依靠改變種植體經皮段或經皮基臺的表面形貌不足以滿足抗菌需求。

在種植體穿皮膚段進行藥物裝載，提高抗感染能力的同時促進與皮膚的整合，是一種非常有前景的方法。但目前常用的銀離子、化學藥物、抗生素等還存在細胞毒性、耐藥性等問題［8－11］?？咕氖且活惿餀C體產生的自我防御性的小分子多肽，具有高效、廣譜的抗菌性能，且具有較好的生物安全性以及不易產生耐藥性等優勢［12］；其中抗細菌肽HHC-36具有良好的應用前景。直接在植入體表面加載藥物雖然可以提高抗菌能力，但由于藥物會在很短時間流失、代謝掉，難以在術后的高危感染期保持最小的抑菌濃度，使用效果不佳。因此需要使用高分子聚合物、高分子微球如聚（乳酸-乙醇酸）（PLGA）、聚乳酸乙醇酸酯（PGLA）、聚蘋果酸、石墨烯微膠囊等等作為緩釋劑，來抑制藥物突釋，實現藥物的持續釋放。其中PDLLA生物相容性好，可降解為對機體無毒、無刺激性的物質，是目前最常用的一類緩釋劑［13］。

因此，為解決目前經皮鈦種植體感染率高的問題，本試驗使用鈦納米管為載體，研究在其表面構筑PDLLA緩釋的HHC-36抗菌涂層的方法，并測試涂層的體外藥物緩釋效果和抗菌性能。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

所有試劑均為分析純，購自西安飛揚生物科技有限公司，抗菌肽由上海生工生物工程股份有限公司合成，金黃色葡萄球菌由第四軍醫大學口腔醫院微生物實驗室提供，穩壓電源 （TPR6010S，深圳市安泰信科技有限公司），紫外分光光度計 （UV-1600，上海美譜達儀器有限公司）。

1.1.1 TiO2納米管的制備及抗菌肽裝載 采用陽極氧化法制備二氧化鈦納米管。直徑10 mm、厚1 mm純鈦片，在400ml去離子水中加入5ml HF，一定速度磁力攪拌下，陽極放入鈦片，陰極為碳棒，20 V電壓下陽極氧化處理4 h。

采用溶劑澆鑄法在制備好的二氧化鈦納米管表面加載藥物。精確秤取2.0 g PDLLA，充分溶解于乙酸乙酯中，加入0.1 g抗菌肽，超聲振蕩，形成5%分散均勻的懸濁液，將試件載藥面浸沒在濁液中2 min，取出靜置晾干后再次浸入，重復3次，室溫下過夜干燥，乙酸乙酯揮發后獲得載藥試件。

1.1.2 緩釋性能的測定 將載藥試件放入1×PBS中，37℃水浴，在不同時間點取出2 ml PBS并補充，第1天0～5 h共取6次，第2～15天每日11：00 AM取樣，通過回歸方程測定取出液中抗菌肽濃度，記錄釋放量。

1.1.3 抗菌性能測試 試件抑菌圈測定：選用金黃色葡萄球菌為指示菌，試驗前將冷凍保存的菌種劃線接種至平板培養基，37℃培養24 h；挑單菌落接種至100 ml液體培養基，37℃、200 r／min搖床培養過夜，菌液備用。使用預加菌液傾注平板法制備試驗平板，往已冷卻至50℃左右的瓊脂平板培養基中注入一定量的菌液，混合均勻，傾注平板 （約20 ml／平板），水平靜置凝固后備用。

抗菌試驗的試件分為3組，1組為PDLLA復合抗菌肽涂層的試驗組，2組為只加載PDLLA的對照組，3組為未載藥的空白對照組。，以環氧乙烷消毒，置入含金黃色葡萄菌的MH瓊脂平板中心位置，載藥面對培養基。37℃恒溫箱培養24 h，取出，觀察抑菌效果，并用游標卡尺測量抑菌圈大小。

2 結 果

2.1 TiO2納米管表面形貌觀察

樣品掃描電鏡觀察結果（圖1A），可見有序排列的納米管陣列，20 V管徑約為80～120 nm。

載藥后電鏡結果（圖1B），可見管口藥物覆蓋。

圖1 TiO2納米管表面形貌（掃描電鏡，×50 000）Fig 1 Surface form of the TiO2 nanotube（SEM，×50 000）

2.2 緩釋性能的測定

按實驗方法中所述取樣，結果見表1。

2.3 抗菌性能測試

在金黃色葡萄球菌平板上裝載試件，獲得了清晰明顯的抑菌圈，且10 d后再次測定，抑菌圈大小基本沒有變化且無細菌長入，抑菌圈大小約15 mm（圖2）。

3 討 論

TiO2納米管制備設備和工藝簡單，適宜于在形狀復雜的物體如種植體表面形成涂層［14］。表面的納米管結構可以提高細胞粘附與增殖［15］，從而更好的與皮膚整合，促進經皮封閉［16－17］，納米管結構本身具有一定的藥物裝載能力，同時也具有一定的抗菌性能。

表1 緩釋實驗吸光度及累計釋放百分比Tab 1 Absorbance and cumulated release percent

圖2 抑菌實驗結果Fig 2 Diameter of the inhibition zone

術后植入物表面不可避免的會有細菌定植并形成細菌生物膜，由于菌膜的存在，生物膜中的細菌耐藥性更高，常規抗生素治療通常無法減少術后種植體周圍感染率［18－19］。理想的方式是在植入體表面構建載藥涂層，使藥物從生物膜內部緩釋并持續作用一段時間，植入體本身雖然有一定的載藥能力，然而其一般沒有控釋能力，難以在術后一定時間的高危感染期保持最小抑菌濃度。HHC-36是一種具有廣譜抗菌能力的抗菌肽，已有實驗證明可以有效殺死經皮感染中常見的金黃色葡萄球菌及革蘭氏陽性菌［20］。PDLLA作為植入物涂層的緩釋材料，不僅有良好的生物相容性，且機械穩定性良好，具有良好的抗血栓能力［13］。

經皮種植體所處皮膚環境易于細菌附著，有證據表明即使經過嚴格的消毒與感染控制，經皮種植手術之后細菌侵襲仍然常有發生，經皮部位感染主要由金黃色葡萄球菌，凝固酶陰性葡萄球菌引起［6－7］?？咕氖且活惙浅Ｓ星熬暗纳锘钚钥咕鷦?，通常為兩親性陽離子肽，抗菌譜廣，其抗菌機制主要為使細菌細胞膜紊亂、抑制其生物大分子合成與表達［21］。Menghan等［22］使用真空輔助的物理吸附方法在80 nm管徑的納米管表面構建了HHC-36抗菌肽涂層，HHC-36抗菌活性測試表明其可以有效殺死金黃色葡萄球菌與格蘭氏陽性菌，加載于TiO2納米管表面后周圍細菌滅殺率達到99.9%，且可以有效降低4 h后附著與表面的細菌總數，抗菌肽還有著幾乎不產生耐藥性的特點［23］。

本實驗在20 V電壓下陽極氧化獲得了管徑為80～120 nm的TiO2納米管試件，并使用了PDLLA作為緩釋劑在TiO2納米管試件表面成功構筑了載HHC-36抗菌肽的緩釋涂層，測定了載藥試件15 d的藥物釋放，獲得表1結果，除第1～2天有一個小幅度突釋，后測試的連續14 d均有持續穩定的藥物釋放，且15 d藥物釋放比達到了46%，可以認為載藥試件具有良好的緩釋性能。在抑菌圈實驗中可見試件周圍約15 mm左右抑菌圈，且10 d之后測定抑菌圈大小基本沒有變化，抑菌圈內也無細菌長入，表明所構建載藥試件有持續有效的抗菌作用。

4 結 論

在100 nm管徑TiO2納米管試件表面成功構建了以PDLLA為緩釋劑的HHC-36抗菌肽涂層，并測定了載藥量與緩釋曲線。對所構建載藥試件的抗菌性能做了相關研究，證明了試件具有良好抗菌性能。

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