NNV衣殼蛋白在大腸桿菌中的表達純化及其應用

朱建蕊 翟偉鋒

摘 要 為獲得穩定表達及較好免疫效力的重組NNV衣殼蛋白，對已公布的石斑魚神經壞死病毒衣殼蛋白基因序列進行優化，并構建表達載體pET32a-NNV，于大腸桿菌BL21（DE3）中誘導、表達，將包涵體純化后碾磨成粉添加到黃粉蟲飼料中，用蟲體粉末喂食石斑魚，攻毒保護試驗檢測免疫效力。結果獲得高表達的NNV衣殼蛋白包涵體，目的蛋白占總蛋白的比率達70%，純化后純度達95%；且喂食本技術制備的黃粉蟲粉末后石斑魚對NNV抵抗力顯著提高，存活率由5%上升至83%。本研究提供一種重組NNV衣殼蛋白在大腸桿菌中高效表達和純化方法，為石斑魚神經壞死病毒疫苗的商品化推廣奠定了基礎。

關鍵詞 石斑魚；神經壞死病毒；衣殼蛋白；疫苗

中圖分類號：S943 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.06.063

石斑魚是一種重要的經濟魚類。神經壞死病毒（NNV）可攻擊石斑魚的神經系統，造成致命性的病毒腦病和視網膜病變[1]，是魚苗培育過程中重大病害之一。一旦爆發，會造成仔、稚魚的大量死亡，成為制約石斑魚養殖業發展的瓶頸。目前，應對方法主要是阻斷傳播途徑、篩選未攜帶病毒的親魚以切斷垂直傳播、利用碘試劑等消毒方法以減少水平傳播，但前者受檢測靈敏度限制，后者無法確保消毒徹底，因此疫苗是防治石斑魚神經壞死病的重要方法之一。至今已基于大腸桿菌、昆蟲細胞和酵母系統成功表達NNV主衣殼蛋白，電鏡下可見病毒樣顆粒形成，動物實驗顯示其具有良好的免疫原性[2]。然而傳統注射重組病毒樣顆粒的免疫方法，雖然對較長魚苗具有較好的免疫保護作用，但對特異性免疫還未成熟的石斑魚稚苗來說，則很難達到防治的目的，因而通過開發口服類疫苗被動免疫稚魚，將是針對稚魚免疫系統特點的較為有效的一種預防措施[3]。

因此本研究以制備穩定表達以及較好免疫效力的NNV衣殼蛋白為出發點，利用基因工程技術獲得高表達的NNV衣殼蛋白包涵體，并建立了一種操作簡單、可行性強的喂食免疫方法，為石斑魚神經壞死病毒疫苗的商品化推廣提供了可能性，具有廣闊的市場前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

pET32a原核表達載體，大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）由本實驗室保存。健康斜帶石斑魚（Epinephelus coioids）以及黃粉蟲（Tenebrio molitor）均由福建水產研究所提供。

1.1.2 試劑

限制性內切酶、連接試劑盒、酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂粉、預染蛋白marker，均購自賽默飛；IPTG，購自麥克林。

裂解液：10 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 7.1）、100 mmol·L-1 NaCl、125 mmol·L-1 咪唑。緩沖液B1：10 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 7.1）、100 mmol·L-1 NaCl、1% TritonX-100。緩沖液B2：10 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 7.1）、100 mmol·L-1 NaCl。均由本實驗室配制和保存。

1.1.3 儀器

超凈工作臺，購自AIRTECH；恒溫搖床購，自上海智城分析儀器制造公司；均質機，購自AVESTIN；超速離心機，購自Thermo Scientific；電泳儀，購自Bio-Rad；凝膠成像儀，購自上海復日科技有限公司；冷凍干燥機，購自上海皓莊儀器有限公司。

1.1.4 培養基

液體培養基：LB培養基、氨芐青霉素抗性LB培養基（抗生素濃度為50 μg·mL-1）；氨芐青霉素抗性固體培養基：

LB液體培養基+1.2%瓊脂粉（抗生素濃度為50 μg·mL-1）。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設計

檢索NCBI數據庫得NNV衣殼蛋白基因序列（accession： KC696562.1），并對其進行優化，第15～18個氨基酸由TKAA變為RG。引物序列設計如下，上游引物：5-CATGCCATGGTACGCAAAGGTGAGAAG-3（劃線部分為NcoⅠ酶切位點）；下游引物：5-CCGCTCGAGTTAAGTGCAGACAGTGCC-3（劃線部分為XhoⅠ酶切位點）?；蚝鸵镄蛄芯商K州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 PCR擴增目的基因

擴增條件為：95 ℃預變性3 min，設定每個循環為95℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，34個循環結束后72 ℃再延伸10 min。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用Omega膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.3 載體構建

將pET-32a載體與回收的PCR產物分別進行NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切產物于25 ℃連接2 h；連接產物全部轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，復蘇后涂布于氨芐青霉素抗性固體培養基。隨機挑取單克隆，使用Omega質粒小量抽提試劑盒提取質粒，對所提質粒作雙酶切驗證，取陽性結果提交蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1.2.4 NNV衣殼蛋白的小量表達

將pET-32a-NNV轉化大腸桿菌BL21（DE3）中，挑取單菌落于6 mL氨芐青霉素抗性LB培養基中，37 ℃、250 r·min-1條件下培養，當OD600達0.6時，取500 μL作為種子液，37℃、220 r·min條件下過夜培養；剩余菌液降溫至25℃，加入IPTG使其終濃度為1 mmol·L-1，于200 r·min-1恒溫搖床中誘導表達12 h。誘導完成后取菌液離心，使用裂解液重懸菌體，超聲破碎，離心取上清和沉淀利用SDS-PAGE分析NNV衣殼蛋白的表達情況。同時取種子液菌體做空白對照。

1.2.5 NNV衣殼蛋白發酵表達

種子液按1∶100比例接入500 mL氨芐青霉素抗性LB培養基中，37 ℃、250 r·min-1條件下恒溫培養，當OD600達0.6時降溫至25 ℃，加入IPTG使其終濃度為1 mmol·L-1，于200 r·min-1恒溫搖床中誘導培養12 h。

1.2.6 NNV衣殼蛋白包涵體純化

菌體使用裂解液重懸，高壓均質機破碎，離心收集沉淀，1）加入緩沖液B1混勻，25 ℃振蕩；2）離心棄上清，加入緩沖液B2混勻，25 ℃振蕩；3）離心棄上清，加入純水混勻，25 ℃振蕩；4）重復步驟上一步驟兩次；5）離心棄上清，取少量沉淀用裂解液重懸，SDS-PAGE分析，剩余沉淀冷凍干燥后碾磨，過80目篩，得NNV衣殼蛋白粉末。

1.2.7 蟲體粉末制備

取3齡期黃粉蟲，將NNV衣殼蛋白粉末按蟲體平均體重的1%添加到黃粉蟲飼料中喂食，培養至4齡期時，將蟲體冷凍干燥，碾磨成粉末，過80目篩。

1.2.8 免疫效力檢測

在2 000 L的放養池中放養健康斜帶石斑魚300尾，將蟲體粉末按魚體重1.5%添加到魚飼料中喂食石斑魚，每周喂食1次，共喂食3次。將感染了神經壞死病的石斑魚加水打碎成漿后離心，以上清為攻毒源投入魚池，16 d內每天統計魚死亡數，以此計算存活率。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增目的基因

以人工合成的NNV衣殼蛋白目的基因序列為模板進行擴增，產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后得約1 000 bp的條帶，與預計的片段長度大小一致，如圖1A所示。

2.2 pET-32a-NNV載體的構建和鑒定

載體和片段分別使用NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切（圖1B），回收后連接。挑單克隆過夜培養、提取質粒并進行雙酶切驗證，經1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后可見線性化的載體下方有1 000 bp左右的條帶（圖1C），測序結果顯示重組質粒pET-32a-NNV序列完全正確。

2.3 NNV衣殼蛋白在大腸桿菌中的小量表達

誘導表達完成經離心收集菌體，重懸后超聲破碎，分別取未誘導全菌、誘導后全菌、破碎后上清和破碎后沉淀樣品進行SDS-PAGE鑒定，結果如圖2A所示，對照未誘導全菌明顯可見約58 kDa處條帶，與預期融合表達標簽的目的蛋白大小基本一致，證明NNV衣殼蛋白在大腸桿菌中可高效表達，且以包涵體形式存在。

2.4 NNV衣殼蛋白發酵表達

由小量表達的結果進行擴大培養，取保存的種子復蘇后按1：100比例接入搖瓶中，培養以及誘導條件與小量表達相同；經收集菌體、裂解液重懸、均質機破碎后，取全菌、破碎后菌體上清以及沉淀進行SDS-PAGE鑒定，結果如圖2B中的1～3所示，可見目的蛋白約占總蛋白量的70%，且以包涵體形式存在于沉淀中。

2.5 NNV衣殼蛋白包涵體純化

對NNV衣殼蛋白包涵體進行純化，按順序分別使用緩沖液B1、B2以及純水與各步所得沉淀混勻后于25 ℃振蕩30 min，最后離心取沉淀用裂解液重懸并進行SDS-PAGE鑒定，結果如圖2B中的4，可見純化后NNV衣殼蛋白包涵體純度達95%。剩余沉淀經冷凍干燥、碾磨、過80目篩獲得NNV衣殼蛋白粉末。

2.6 蟲體粉末制備

正常喂食以及將NNV衣殼蛋白粉末作為飼料添加劑喂食的黃粉蟲分別代表對照組和實驗組。兩組除飼料成分有差別外，其他條件均相同。進而分別將兩組蟲體冷凍干燥后碾磨成粉得對照組和實驗組蟲體粉末。

2.7 免疫效力檢測

喂食對照組和實驗組黃粉蟲粉末的石斑魚分別對應對照組和免疫組石斑魚，兩組石斑魚除飼料成分有差別外，其他條件均相同。3次喂食后進行攻毒保護試驗，攻毒源投入后，一些魚類出現神經紊亂癥狀并伴有螺旋式游泳，對16 d內石斑魚存活率進行統計，結果見表1。隨時間的延長，兩組石斑魚存活數量均有下降，而16 d后實驗組石斑魚存活率達83%，對照組卻僅為5%。對16 d內兩組石斑魚數量對比，表明喂食本技術制備的NNV衣殼蛋白粉末的石斑魚對NNV抵抗力較對照組明顯提高，能有效抵抗神經壞死病癥。

3 討論

隨著石斑魚人工繁育技術的突破，我國石斑魚工業化養殖不斷發展，但長期存在的神經壞死病毒對石斑魚養殖業造成嚴重威脅，應對措施主要是阻斷病毒的垂直傳播和水平傳播，但均存在安全隱患；提高病毒檢測靈敏度是重要的研究方向之一，目前已建立PCR法、ELISA、細胞培養以及組織病理方法等檢測、診斷技術，但實際情況下受到檢測特異性、細胞培養以及制備病毒抗體等方面的限制[4]。另有報道使用天然免疫增強劑作為餌料添加或直接拋灑，但多為輔助手段，因此在石斑魚魚苗的培育過程中，疫苗是防治神經壞死病癥的重要方法，相對傳統滅活苗，基因工程疫苗成本低、免疫原性好、安全性高的優點顯著，是疫苗研發的重要方向，目前研究主要集中在亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗以及DNA疫苗的制備。

本研究利用基因工程技術在大腸桿菌中高效表達NNV衣殼蛋白，pET表達質粒含有強啟動子，可相對較高效表達外源蛋白，因此本實驗根據前期實驗結果，采用pET32a載體，并對NNV衣殼蛋白氨基酸序列進行優化，最終獲得以包涵體形式存在的高表達的目的蛋白，融合表達的蛋白分子量約為58 kDa，相對于可溶性表達的目的蛋白，其優勢在于大大提高了表達量，同時具有高穩定性的特點，為工業化生產提供了可能[5]。

然而傳統注射免疫方法操作繁瑣，大規模使用受限，而口服類疫苗操作簡單、可行性強，并且可針對稚魚免疫系統特點，被動免疫稚魚，是目前較理想的一種預防措施。因此，本研究對NNV衣殼蛋白包涵體進行純化、冷凍干燥得衣殼蛋白粉末，將喂食NNV衣殼蛋白粉末的黃粉蟲作為石斑魚飼料添加劑，操作簡單，可行性強，攻毒保護試驗得出本研究使用的免疫技術對石斑魚具有良好的免疫保護性效果，能有效抑制石斑魚神經壞死病。且本技術所涉及的黃粉蟲養殖，操作簡單、周期短、成本低、節省空間；另黃粉蟲養殖不傳播疾病，無需防疫。此外與注射免疫的方法相比，喂食免疫方法可行性強，僅在常規飼料中多添加喂食NNV衣殼蛋白的黃粉蟲粉末一種原料即可實現明顯免疫效果，極大地提高了工作效率。

4 結論

本研究成功實現了石斑魚神經壞死病毒衣殼蛋白的高效穩定表達，同時基于NNV衣殼蛋白包涵體，采用喂食免疫法實現對石斑魚的免疫防治，為實行石斑魚神經壞死病毒疫苗的商品化奠定了基礎。

參考文獻：

[1] Nakai T， Mori K， Sugaya T， et al. Current knowledge on viral nervous necrosis （VNN） and its causative betanodaviruses[J].The Israeli journal of aquaculture-Bamidgeh，2009，61（3）：198-207.

[2] 陳文捷，劉曉丹，胡先勤，等.魚類神經壞死病毒研究進展與發展趨勢[J].水產學報，2014，38（9）：1666-1672.

[3] Thorarinsson R， Powell D B. Effects of disease risk， vaccine efficacy， and market price on the economics of fish vaccination[J].Aquaculture，2006，256（1-4）：42-49.

[4] 劉濱，劉新富，曾霖，等.七帶石斑魚神經壞死病毒的RT-LAMP檢測方法[J].天津農業科學，2016，22（7）：23-28.

[5] 陳曉艷，翁少萍，殷志新，等.斜帶石斑魚神經壞死病毒主衣殼蛋白的原核表達與純化[J].中山大學學報（自然科學版），2005，44（6）：83-86.

（責任編輯：劉昀）