外引大麥農藝性狀SSR關聯位點及等位變異表型效應分析

賴 勇，呂仲昱，賈建磊，盧九斤，王晉民，朱惠琴，馬 輝，田 豐，楊莉娜，李宗仁

(1.青海大學農牧學院，青海西寧 810016；2.三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，青海西寧 810016；3.甘肅隆源農業科學研究所，甘肅蘭州 730070)

大麥是青藏高原的主栽作物之一。遺傳基礎狹窄是目前大麥育種家面臨的嚴重困境[1]，而引進種質資源是解決該問題的有效手段。借助分子標記技術對引進的種質資源進行遺傳分析，發掘不同材料所含的有利等位變異，對于作物育種的親本選擇、組合配制和標記輔助育種具有重要意義?；赟SR標記的遺傳多樣性、基因定位和關聯分析在各類作物中廣泛應用[2-4]。國內外也有許多關于大麥SSR遺傳多樣性分析的報道[5-7]。通過關聯分析尋找與目標性狀相關的位點，分析其對目標性狀的貢獻率是發掘有利基因的主要方法[8-12]。但是目前，大量關聯分析都停留在標記或位點水平，鮮有具體分析相關位點各等位變異的表型效應。對于SSR位點，在自然群體中通常能檢測到多個等位變異，每個等位變異的遺傳效應存在差異[13-14]。分析每一個等位變異的表型效應對于分子標記輔助選擇育種具有指導意義。Breseghello和Sorrells[13]在進行小麥籽粒直徑及磨粉品質與SSR標記關聯分析中，以無效等位基因(null allele)材料為對照，分析各等位變異的表現效應值，發掘出其中可以增大籽粒直徑和提高磨粉品質的有利基因。此方法給作物關聯作圖中，具體分析不同等位基因的表型效應、發掘有利基因提供了新思路。Zhang等[14]利用Breseghello和Sorrells[13]的方法尋找到降低小麥株高的有利等位變異。文自翔等[15]采用該方法從我國栽培大豆和野生大豆中鑒定出許多與農藝性狀以及品質性狀相關聯的優異等位變異。在大麥上，還未見基于SSR位點對引進種質不同等位變異表型效應進行分析的報道。

本研究在以前對大麥引進國外種質資源進行遺傳多樣性和GLM關聯分析[16]的基礎上，進一步采用MLM關聯分析，檢測大麥農藝性狀關聯位點，并分析關聯位點上不同等位變異的表型效應，以期為青海省大麥分子標記輔助選擇提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 種植材料及農藝性狀鑒定

55份國外引進大麥品種包括19份丹麥品種、12份匈牙利品種、12份德國品種以及少量其他國外引進栽培品種，分別于2014年3月29日、2015年3月28日種植于青海大學農牧學院試驗地。這些材料為沒有直接親緣關系的自然群體，符合關聯分析發掘有利等位變異的條件。材料名稱、來源及種植情況等詳見文獻[16]。于分蘗期采幼嫩葉片，-80 ℃保存備用。在各材料成熟后，每個材料隨機抽取10個單株，測定株高、穗長、穗下莖長、千粒重、全生育期等農藝性狀。各材料具體農藝性狀指標已在文獻[16]中報道。

1.2 混合模型關聯分析

通過軟件SPAGeDi構建親緣關系矩陣(K)，結合前文GLM分析中獲得的Q參數[16]，以Q+K的方法采用混合線性模型(mixed linear model，MLM)在Tassel 2.1 軟件中運行，檢測與農藝性狀相關聯的標記，P<0.01時為陽性關聯位點。以軟件Origin 8.0繪制關聯位點圖。

1.3 等位變異表現效應分析

參考Breseghello和Sorrells[13]提出的無效等位變異(null allele)方法，區分有效等位變異和無效等位變異，對MLM模型中與農藝性狀相關聯的位點，分析其不同等位變異的表型效應。具體表型效應計算方法：

ai=∑xij/ni-∑Nk/nk

式中ai為第i個等位變異的表型效應值，xij表示含有第i個等位變異的第j個材料性狀表型測定值，ni為含有第i個等位變異的材料數，Nk為攜帶無效等位變異的第k個材料的表型測定值，nk為具有無效等位變異的材料數。若ai值為正， 則認為該等位變異為正向(或增效)等位變異，反之為負向(或減效)等位變異。以軟件Origin 8.0繪制效應值柱形圖。

當某性狀同時有多個正向(或負向)等位變異或多個相關聯位點時，參考文自翔等[15]方法計算各位點全部增效或減效等位變異的平均效應[average positive(negative)allele effect of locus，AAE]，評價該位點的整體增效或減效能力。

AAE=∑ac/nc

式中ac為某關聯位點內第c個增效(或減效)等位變異表型效應值，nc為位點內增效(或減效)等位變異數。增效(或減效)比例：AN=AAE∑NK/nK×100%

2 結果與分析

2.1 MLM關聯分析結果

經MLM關聯分析，共檢測到15個與株高、穗長、穗下莖長、千粒重和全生育期關聯的位點(P<0.01)，其中位點GBMS2和HVM33均與穗長和千粒重相關聯，位點HVM33、HVM60和Bmac316均與千粒重相關聯(P<0.001)(圖1、表1)。各位點分別位于除1H、5H外的其余5條染色體上，不同位點對表型變異的解釋率變化范圍為3.19%～24.30%(表1)。與千粒重相關聯的位點最多，有6個，只有一個位點HV13GEIII與全生育期關聯。

圖1 與所測農藝性狀相關聯的15個SSR位點

Table1ContributionoflocustoagronomictraitsunderMLM

位點Locus染色體Chromosome圖距Position/cM農藝性狀Agronomictrait/%株高Plantheight穗長Spikelength穗下莖長Lengthofearstem千粒重Thousandkernelweight全生育期DaystomaturityGBMS22HS506．6317．6624．30EBmac6842HL803．22Bmag1252HL12214．99HVM333HL9416．0914．41HVM603HL11017．07HV13GEIII3HL15512．59Bmac293HL1901．88EBmac7754HL803．19HVJASIP4HL1801．42Bmac3166HS620．31GMS066HL9612．17GBM10876HL12817．61Bmac406HL15517．88Bmag77HS273．42EBmac6037HS503．66

下劃線表示在0.001水平相關聯位點。

The underlined number showed locus associated with agronomic trait at 0.001 level.

2.2 等位變異表型效應分析

15個關聯位點中，HVM33、Bmac40、EBmac775、EBmac603、Bmag125、HVM60和Bmac1367位點上檢測到無效等位基因。這7個位點上共有22個不同有效等位變異，其中Bmac40-2、EBmac755-2和EBmac755-4等6個等位變異對表型具有正向效應，其余均為負向效應(圖1)。與穗長相關聯的位點HVM33和Bmac40上共檢測到1個具有正向效應的等位變異和6個具有負向效應的等位變異(圖2A)，且負向效應明顯大于正向效應。與株高相關聯的位點上共檢測到3個具有正向效應的等位變異和5個具有負向效應的等位變異(圖2B)，其中等位變異EBmac775-4的正向效應值最大(+31.7 cm)，EBmac603-5具有最大負向效應(-25.6)。與千粒重相關聯的3個位點上共檢測到10個有效等位變異，其中2個為正向效應，8個為負向效應(圖2C)。

2.3 整體平均效應分析結果

在7個相關聯位點中，等位變異平均效應以負向為主(表2)。與穗長相關聯的2個位點HVM33和Bmac40上，等位變異平均效應均為負向，且平均效應差異較小，分別為-1.6 cm 和-1.0 cm。與株高相關聯的位點中，EBmac775的等位變異平均效應為+16.91 cm，EBmac603為-13.35 cm。與千粒重相關聯的位點中，HVM60等位變異平均效應為正向，HVM33、Bmag125和Bmac316三位點的等位變異平均效應均為負向。

圖2 穗長、株高和千粒重關聯位點等位變異表型效應

Table2Averageeffectsofallelicvariationsassociatedwithspikelength,plantheightandthousandkernelweight

性狀Trait位點Locus平均效應Averageeffect正向Positiveeffect負向Negativeeffect穗長Spikelength/cmHVM33--1．6(-17．78)Bmac40--1(-11．11)株高Plantheight/cmEBmac775+13(+16．91)-EBmac603--13．35(-14．05)千粒重Thousandkernelweight/gHVM33--8．2(-15．80)Bmag125--3．8(-8．14)HVM60+19．03(+58．3)-Bmac316--3．3(-6．79)

括號內為與無效等位變異相比較的平均正向(或負向)效應占的比例(%)。

The number in parentheses indicates the proportion(%) of average positive(negative) allele effect of locus compared with the effect of null allele.

3 討 論

對引進種質資源進行關聯分析以發掘有利等位變異，是進行分子標記輔助選擇的基礎。本研究采用SSR標記技術對國外引進的大麥品種進行MLM關聯分析和等位變異表型效應分析，為后期大麥分子標記輔助育種提供了一定的理論依據。一些研究結果表明，關聯分析中的MLM模型比GLM模型的結果準確，可以更有效地降低偽關聯[17-19]。本研究在前文的基礎上進一步采用MLM模型進行關聯分析，共檢測到15個與株高、穗長、千粒重等農藝性狀相關聯的位點，與GLM模型相比[16]，檢測到的關聯位點有所減少，且各位點對表型的解釋率明顯低于GLM模型。因此，在進行等位變異的表型效應分析中，集中于MLM模型中檢測到的關聯位點。

具體分析某一位點等位變異的效應值，有助于發掘其中的有利等位變異，為分子標記輔助育種提高更詳細的依據。魏添梅等[20]以抗旱小麥材料為對象進行分子標記與株高的關聯作圖時，以優良材料含有的等位變異作為優異等位變異。但是這種方法不能具體分析每一個等位變異的表型效應值，不能給分子標記后期輔助選擇提供更翔實的依據。這種分析方法僅對于沒有檢測到無效等位變異的位點具有一定的借鑒意義。當檢測到無效等位變異的位點時，采用Breseghello和Sorrells[13]的方法更具優勢。因此在進行等位變異表型效應分析時，可以綜合兩種方法評價種質資源所含等位變異的優異程度。本研究從不同位點上共檢測到7個無效等位變異，以之為對照，對每個有效等位變異的表型效應進行具體分析。穗長關聯位點上，只有等位變異Bmac40-2具有正向效應(+0.4 cm)，是增加穗長優異等位變異。株高關聯的位點上，有5個可以降低株高的優異等位變異，以等位變異EBmac603-4(-17.6 cm)和EBmac603-5(-25.6 cm)最顯著。千粒重關聯的等位變異中，只有HVM60-1和HVM60-12，為正向效應，效應值分別為+13.5 g和+12.0 g，可以作為提高千粒重的優異候選等位變異。在分子標記后期標記輔助選擇時，在穗長方面，可以標記Bmac40進行檢測，含有Bmac40-2等位變異的個體則具有較大穗長的趨勢；在千粒重方面，可以標記HVM60進行檢測，含有HVM60-1和HVM60-12等位變異個體的千粒重將更大。

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