煙草β—1，3—葡聚糖酶的特性和結構分析

劉彪　楊柳 羅萬麟　趙爽　殷雪艷

摘要 [目的]對煙草β-1，3-葡聚糖酶的特性和結構進行分析。[方法]以煙草為材料，采用PROTSCALE、TargetP 1.1、NPSA-PRABI和SWISS-MODEL工具分別測定煙草葡聚糖酶的疏/親水性、亞細胞定位、二級結構和三級結構。[結果]NtBGl屬于親水性蛋白，NtBGl-1和NtBGl-2的疏/親水性較為相似，N端和中部區域的疏水性較強，NtBGl-3以N端的疏水性較強；NtBGl均含有信號肽，且其切割位點分別位于第21、32和29位氨基酸處，NtBGl-1和NtBGl-2定位于液泡，NtBGl-3定位于細胞外；NtBGl的二級結構均以α-螺旋比例最大，依次為36.21%、35.14%、35.28%，三級結構呈現“C”型。[結論]該研究可為有效發揮煙草葡聚糖酶的功能特性奠定基礎。

關鍵詞 煙草；β-1，3-葡聚糖酶；結構；特性

中圖分類號 S572 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）18-0076-03

Characterization and Structure Analysis of Tobacco β1，3Glucanase

LIU Biao， YANG Liu， LUO Wanlin et al

（Liangshan Tobacco Company， Xichang，Sichuan 615000）

Abstract [Objective]To study the characteristics and structure of tobacco β1，3glucanase.[Method]Tobacco was used as test material， PROTSCALE， TargetP 1.1， NPSAPRABI and SWISSMODEL tools were used to determine the hydrophile/hydrophilicity， subcellular location， secondary structure and tertiary structure of tobacco glucanas. [Result] NtBG1 belonged to the hydrophilic protein， NtBGl1 and NtBGl2 had similar sparse/hydrophilic properties， Nterminal and central region had strong hydrophobic， NtBGl3 only had hydrophobicity at Nterminal. NtBGl contained a signal peptide with cleavage sites at amino acids 21， 32 and 29， NtBGl1 and NtBGl2 localized to the vacuole， and NtBGl3 localized outside the cell. The secondary structure of NtBGl in alpha helix proportion was the largest， followed by 36.21%， 35.14%， 35.28%， The tertiary structure showed “C” type.[Conclusion]The study can lay a foundation for playing the functional properties of tobacco glucanase.

Key words Tobacco；β1，3glucanase；Structure；Characteristics

β-1，3-葡聚糖酶具有兩種重要的功能[1]，一種為降解植物細胞壁，促使植物體軟化[2]，另一種為病原微生物入侵時，體內葡聚糖酶的含量和活性增加，從而抵抗真菌和細菌的入侵[3-5]。植物葡聚糖酶的含量和活性增加，不僅可以依靠外來微生物的入侵，還可以通過外源植物激素，如水楊酸和乙烯等[6-8]，進而增加植物的抗性。研究表明，根據植物葡聚糖酶的定位和功能特性，葡聚糖酶被劃分為四類：堿性葡聚糖酶（定位于液泡）、酸性葡聚糖酶（定位于胞間隙）、胞外誘導型和胞外非誘導型葡聚糖酶[9]，堿性葡聚糖酶具有破壞并降解病原菌細胞壁的作用[10]，而酸性葡聚糖酶無抑制病菌的活性[11]。目前，對于煙草葡聚糖酶的研究主要為煙草相關病原微生物與葡聚糖酶的關系[12-15]。筆者通過生物分析法，更深次地研究煙草葡聚糖酶的序列特性，以期為有效發揮煙草葡聚糖酶的功能特性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 篩選煙草β-1，3-葡聚糖酶家族成員

采用PROTEIN[16]數據庫在線檢索，篩選煙草葡聚糖酶相關的蛋白序列，獲取的登錄號分別是AAA63541.1、ACF93731.1和AAA63542.1，依據優勢氨基酸和氨基酸數進行命名，分別為NtBGl-1、NtBGl-2和NtBGl-3[17]。

1.2 方法

采用Hphob./ Kyte & Doolittle法，且利用線性的重量變化模型，以PROTSCALE工具[18]測定煙草葡聚糖酶序列的疏/親水性；使用TargetP 1.1的在線服務[19]，獲取煙草葡聚糖酶的亞細胞結構及其相關數據；采用NPSA-PRABI工具[20]，測定煙草葡聚糖酶的二級結構，其Similarity threshold值為8，構象類型為4；使用SWISS-MODEL工具[21]，根據同源相似原理，構建煙草葡聚糖酶的三級結構。

2 結果與分析

2.1 煙草β-1，3-葡聚糖酶的疏/親水性分析

由圖1可知，NtBGl-1和NtBGl-2疏/親水性較為相似，含有相同的最大值（2.956）甘氨酸，即疏水性相對較強，但位置不同，NtBGl-1的最大值位于第8位甘氨酸，而NtBGl-2位于第19位甘氨酸，此外，NtBGl-1和NtBGl-2含有相同的最小值（-2.833）精氨酸，即親水性相對較強，NtBGl-1的最小值位于第231位精氨酸，NtBGl-2位于第242位精氨酸，2組序列均以N端和中部區域的疏水性較強，整體的疏/親水性值分別為-0.112和-0.137，則NtBGl-1和NtBGl-2均為親水性蛋白；NtBGl-3以第18位甘氨酸值最大（3.356），即疏水性相對較強，以第317位天冬酰胺的最?。?2.500），即親水性相對較強，且該序列僅以N端的疏水性較強，整體的疏/親水性值為-0.113，則NtBGl-3屬于親水性蛋白。綜上所述，NtBGl的各成員均屬于親水性蛋白，且疏水區域為N端。

2.2 煙草β-1，3-葡聚糖酶的亞細胞定位和二級結構分析

為明確NtBGl屬于4種類型的哪幾種，以及在特定的亞細胞中發揮作用，依據氨基酸序列的信號肽對NtBGl進行亞細胞定位。由表1可知，序列長度為359 aa的NtBGl-1，在第21位存在切割位點（概率為0.967），根據信號肽判斷NtBGl-1可能定位于液泡或細胞外，但定位于液泡的分值（4.0）大于細胞外（1.0），因此NtBGl-1定位于液泡；NtBGl-2的序列長度為370 aa，于第32位處存在切割位點（概率為0.838），定位于液泡內，其可靠性相對較低，級別為2；NtBGl-3定位于細胞外，其切割位點位于343 aa的第29號，概率最大（0.991），且級別為1。NtBGl二級結構在一定程度上決定高級結構，影響蛋白序列的功能，為此，對NtBGl序列的無規則卷曲、β-折疊、β-轉角和α-螺旋組成含量進行分析。由圖2可知，NtBGl-1、NtBGl-2和NtBGl-3的無規則卷曲分布無規律可尋，其所占比例依次為31.75%、33.78%、31.78%；NtBGl-1和NtBGl-2的β-折疊相對集中，而NtBGl-3較為分散，所占比例依次為21.73%、21.35%、20.12%；β-轉角于整個序列中

所占的比例最小，依次為10.31%、9.73%、12.83%；NtBGl-1和NtBGl-2的α-螺在序列中表現為每隔50個氨基酸出現1次較為集中的α-螺序列，而NtBGl-3僅表現在中間和C端區域，NtBGl的α-螺所占比例最大，分別為36.21%、35.14%、35.28%。

2.3 煙草β-1，3-葡聚糖酶的三級結構分析

經Blast和HHBlits的同源比對方法，依據NtBGl的氨基酸序列，檢索SWISS-MODEL的三級結構數據庫，經篩選，以巴西橡膠樹的糖基化β-1，3-葡聚糖酶的晶體結構和馬鈴薯內切-1，3-β-葡聚糖酶為模板（其模板序列分別4hpg.1和4gzi.1），構建NtBGl的三級結構，結果如圖3。NtBGl-1和NtBGl-2依據巴西橡膠樹的糖基化β-1，3-葡聚糖酶的晶體結構，構建三級結構，其中NtBGl-1以0.87%的覆蓋率和63.78%的相似度獲得其三級結構，含有的β-折疊、β-轉角和α-螺旋數依次為22、30和16個；NtBGl-2的覆蓋率為0.84%，其相似度為64.10%，二級結構數與NtBGl-1相同；NtBGl-3依據馬鈴薯內切-1，3-β-葡聚糖酶構建三級結構，覆蓋率和相似度均最大，分別為0.92%和79.30%，β-折疊、β-轉角和α-螺旋數分別為21、33和17個；NtBGl-1、NtBGl-2和NtBGl-3的三級結構均表現為“C”型，因此，NtBGl通過中間的功能域參與相應的生理反應。

3 結論與討論

NtBGl的各成員均屬于親水性蛋白，且疏水區域為N端，有利于NtBGl形成跨膜結構，錨定于特定的質膜上發揮作用[22]；NtBGl-1和NtBGl-2均定位于液泡中，表明該蛋白屬于堿性β-1，3-葡聚糖酶，即該蛋白可能參與降解病原菌菌絲，增加植物的抗性[23]，NtBGl-3屬于酸性β-1，3-葡聚糖酶[9]；NtBGl-1、NtBGl-2和NtBGl-3的二級結構均以α-螺旋的比例最大，有利于保證三級結構的穩定[17]；NtBGl的三級結構表現為“C”型，說明該酶的催化活性區可能位于空間結構的凹陷處。

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