RAGE阻斷劑FPS-ZM1對心肌缺血再灌注損傷的作用研究

針對急性心肌梗死病人,實施及早、有效的再灌注治療如溶栓或者經皮冠脈介入,是減少梗死面積、改善臨床預后的治療措施[1]。然而,恢復血流的同時有可能帶來局部細胞凋亡、炎癥或者氧化負荷,導致不可逆細胞損傷,這種現象即心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)。MIRI可引起心臟功能不全包括心律失常、微血管損傷和細胞死亡。損傷機制包括大量活性氧(ROS)激活、鈣超載、促炎性因子釋放、凋亡發生、中性粒細胞浸潤、內皮細胞功能不全[2-3]。如何減輕和避免MIRI成為再灌注治療的重要內容。大量實驗表明,遠端缺血預適應(remote ischemic percondition-ing,RIPerC)[4]和缺血后適應(remote ischemic postconditioning,RIPostC)[5]干預措施能夠減輕缺血再灌注損傷。

最近研究把晚期糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)放在介導MIRI的信號通路的中心位置。RAGE是一種多配體的膜受體,可表達于大多數組織和一系列細胞中,在炎癥發展過程中起到重要作用,與配體高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box 1,HMGB1)、晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products,AGEs)、β 淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ) 等結合后,可啟動多條信號通路,引起細胞內氧化應激和炎癥反應,細胞功能紊亂,導致糖尿病、動脈粥樣硬化、MIRI等疾病的發生[6]。FPS-ZM1(FZM1)是RAGE的特異性阻斷劑[7-8],本文將著重探究FZM1在小鼠MIRI模型中的具體作用及其信號通路。

1 材料與方法

1.1 材料 7～9周齡健康雄性C57BL/B6小鼠(南京青龍山動物中心)32只,體質量20～25 g,無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級。使用儀器和試劑:小鼠呼吸機,小鼠心超儀(Vevo770 imaging system,加拿大),顯微手術器械,自制小鼠氣管插管,伊文氏藍(Evans blue,Sigma公司,美國),BCA蛋白定量,試劑盒(碧云天公司,上海),抗RAGE、HMGB1、P-ERK1/2(cell signaling公司,美國),抗ERK1/2抗體、GAPDH抗體(Bioworld 公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心肌缺血再灌注模型的建立:小鼠腹腔內注射1%戊巴比妥,通過自制小鼠氣管導管成功連接小鼠呼吸機(呼吸頻率90～100次/min),核心體溫保持在37 ℃左右。在第3、4肋間開胸,暴露出左心耳及左心室,在左心耳下緣2 mm處用7-0的帶線縫合針橫穿于冠狀動脈前降支并結扎(打一活結),觀察左心室前壁顏色由紅色逐漸變白色并且室壁運動減弱表明結扎成功,45 min之后打開活結實現缺血后的再灌注,封胸。

1.2.2 實驗分組與干預:小鼠隨機分為4組,即假手術組(sham組,連續腹腔注射1周生理鹽術,開胸,不結扎),FPS-ZM1對照組(FZM1組,連續腹腔注射1周1 mg/kg FPS-ZM1,開胸,不結扎),缺血再灌注組(I/R組,腹腔注射生理鹽水,結扎左冠狀動脈45 min),FPS-ZM1干預組(FZM1+I/R組,手術前腹腔注射FPS-ZM1,結扎左冠狀動脈45 min)。

1.2.3 血流動力學測定:再灌注1周后,小鼠給予1%戊巴比妥鈉,通過M型超聲(Vevo770 imaging system,加拿大)測定左室射血分數(left venricular ejection fraction,LVEF)、左室縮短分數(left venricular fractional shortening,LVFS)。

1.2.4 蘇木精-伊紅(HE)染色：小鼠超聲檢測后，取出心臟組織放入4%的甲醛溶液中24 h，使用切片機切取5 μm左右的組織, HE染色后在光鏡下觀察心肌超微結構變化。

1.2.5 Western blot:再灌注24 h后取出心臟,加入組織裂解液,用BCA蛋白定量試劑盒(碧云天)測定總蛋白,加入一定比例的蛋白上樣緩沖液100 ℃煮5 min, 取30 μg蛋白進行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉移至PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉2 h,分別加入GAPDH(1∶10000),抗RAGE(1∶1000),抗HMGB1(1∶1000),抗P-ERK(1∶1000),抗ERK(1∶500),4 ℃過夜,洗膜3次,每次10 min,加入含有辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶10000),室溫2 h,洗膜,最后ECL,孵育,曝光。

1.3 統計學處理 所有數據應用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析,結果以均數±標準差表示,組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血流動力學指標的變化 與sham組和FZM1組相比,I/R組小鼠心臟收縮功能指標(LVEF、LVFS)明顯降低；與I/R組相比,FZM1+I/R組LVEF及LVFS均有所上升,說明FZM1能使MIRI小鼠的心臟收縮功能得到一定恢復(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠LVEF、LVFS比較%,n=8)

注: 與 sham組比較,*P<0.05;與I/R 組比較,△P<0.05;與FIM1組比較，#P<0.05

2.2 HE染色 與sham組相比,I/R 心肌纖維結構排列紊亂,發生細胞壞死,炎細胞浸潤明顯,與I/R組相比,FZM1+I/R組的心肌壞死灶面積有一定縮小,炎性細胞浸潤明顯減少。見圖1。

圖1 各組心臟組織的鏡下超微結構

2.3 蛋白表達比較 與sham組相比,I/R組RAGE及HMGB1表達量升高(P<0.05);與I/R組相比,FZM1+I/R組RAGE及HGMB1表達量顯著減少(P<0.05),而P-ERK/ERK表達量顯著上升(P<0.01)。見圖2，3。

圖2 各組蛋白表達的Western blot

3 討論

再灌注治療,尤其是溶栓和抗血小板治療能夠顯著改善急性心肌梗死病人的臨床預后,然而再灌注治療之前的缺血損害[9],可以觸發ROS系統的激活,導致心肌細胞的功能障礙,細胞死亡及炎癥反應[10]。最近幾年，不少學者已經關注于研制出有效的藥物干預措施去加強缺血再灌注損傷的心肌耐受程度。

注:與 sham組比較,*P<0.05; 與I/R 組比較, △P<0.05圖3 心肌組織RAGE、HMGB1、P-ERK/ERK蛋白表達變化

之前研究已經指出，RAGE及其配體已經參與到MIRI, AGEs和其他的促炎性因子以及組織損傷性配體與RAGE結合后,能夠激活許多重要的下游通路。部分研究報道可溶性晚期糖基化終末產物受體(soluble advanced glycation end products,sRAGE)干預或者基因敲除RAGE之后,能夠保護再灌注心臟面免受損傷和功能不全,改善心臟功能和代謝[9]。本研究通過藥物FZM1干預缺血再灌注小鼠成功阻斷RAGE(可能是FZM1直接成功阻斷RAGE表達),小鼠心臟的HE染色結果顯示,心肌細胞發生炎癥、壞死、水腫的程度明顯減輕,心臟LVEF由(48.23±0.74)%升高到(52.59±1.05)%,LVFS由(23.74±0.29)%升高到(26.37±0.29)%。

HMGB1是一種非染色體核蛋白,參與穩定核小體和調控基因表達,能夠從激活的免疫細胞中主動釋放出來,或者從壞死和凋亡細胞中被動釋放出[11]。研究證實，細胞外的HMGB1是一種潛在的促炎性因子,能夠促進中性粒細胞聚集并激活單核細胞釋放更多的炎性因子,在MIRI中有助于放大炎性反應[12-14]。本實驗結果顯示I/R組的HMGB1蛋白表達量較sham組明顯增加,且HE圖片上顯示I/R組心肌發生明顯炎癥,說明手術干預使心肌細胞發生了壞死或者凋亡等應激之后,釋放了許多促炎性因子，促使心肌組織發生炎癥反應,而HMGB1引導的炎癥反應主要是通過激活RAGE來實現的[15]。在慢性間歇缺氧(chronic intermittent hypoxia,CIH)動物模型中,HMGB1可能是sRAGE的主要作用靶點,腹腔注射sRAGE(相當于阻斷RAGE表達)能在一定程度上降低由CIH引起的RAGE及HMGB1釋放量,sRAGE可能是通過下調HMGB1發揮抗炎作用的[16]。根據以上研究結果,本實驗Western blot結果可解釋為兩方面原因:其一,FZM1(阻斷RAGE)干預可以直接下調由I/R引起的HMGB1蛋白表達而發揮保護作用。其二,根據HE染色結果,可判斷出FZM1能夠降低由I/R導致的發生壞死或者凋亡的心肌細胞數目比例,進而減少由心臟組織中壞死細胞釋放的HMGB1總量。另有報道稱在缺血性心臟病中,血管緊張素轉化酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEI)或者血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑能夠上調血管緊張素轉換酶-2(angiotensin converting enzyme-2,ACE2)的水平,通過阻斷HMGB1下游炎癥信號的傳遞起到心臟保護作用,能夠使心臟收縮功能指標LVEF值提高21%[17]。本研究中FZM1對缺血再灌注的保護作用可能就是通過阻斷HMGB1-RAGE信號軸來抑制HMGB1下游信號的傳遞,而使得心臟收縮功能增強。HMGB1可以通過與其特異性受體包括RAGE、toll樣受體-2(toll-like receptor-2,TLR-2)、TLR-4結合發揮促炎作用[18],配體與受體的結合能夠激活核轉錄因子(NF-kB)釋放,或者通過影響絲 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 (mitogen activated protein kinase, MAPK) 信號[19],最終導致大量炎性因子的表達增加和釋放。由此可見,HMGB1與RAGE信號軸是一條重要的炎性信號通路,可以介導MIRI的發生發展。MAPK是蛋白酶超家族,由細胞外信號調控酶和細胞外信號調節蛋白激酶(extracellular signal regulated protein kinase, ERK1/2) 、c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38 組成。MAPK中的p38和JNK能夠引起炎癥、細胞凋亡[20],而ERK1/2的作用比較復雜,有文獻報道長時間的MIRI,ERK1/2以介導損傷細胞為主,而在早期的損傷中,ERK參與細胞的內源性保護,ERK信號是RAGE下游通路的部分組成成分[21]。在哮喘疾病模型中,已經證實HMGB1可以通過激活RAGE及其下游信號ERK1/2起到損傷呼吸道上皮屏障功能的作用。而本實驗證實，FZM1+I/R組的P-ERK水平明顯比I/R組高(總的ERK在各組之間無明顯差異),可推斷出阻斷HMGB1與RAGE的結合會進一步激活其下游信號成分ERK1/2,從而起到保護MIRI的作用。不少文獻報道藥物干預間接激活ERK1/2后,可有效減輕心肌梗死[22],由此根據本實驗結果可解釋為:小鼠MIRI給予FZM1干預后,先抑制了HMGB1與RAGE信號傳導軸,后激活二者的下游信號分子ERK1/2。

綜上所述,藥物FPS-ZM1可以通過阻斷HMGB1-RAGE 信號軸,激活其下游信號是MAPK/ERK成分,減輕由MIRI導致的心肌壞死、水腫及炎癥的程度,并且能改善心臟收縮功能。以上結果表明,RAGE很可能成為臨床上預防MIRI的一個潛在治療靶點。

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