人臍帶間充質干細胞修復老齡嚙齒類動物Ⅲ度壓瘡的效果研究

壓瘡(pressure ulcers)是指局部組織長時間受壓,血液循環障礙,局部持續缺血、缺氧、營養不良而致的軟組織潰爛和壞死,多見于大型外科術后[1]、腦脊髓損傷等導致的活動能力受限的病人[2]、ICU[3]以及臥床不起的老年病人。目前,世界人口老齡化程度加劇且護理人力資源短缺,改善與更新壓瘡、潰瘍等慢性傷口的護理管理迫在眉睫[4-5]。隨著干細胞研究的深入及再生生物醫學的發展,人臍帶間充質干細胞 (human umbilical cord mesenchymal stem cells, huMSCs)以其高分化潛能、高增殖力、低免疫原性、取材方便、無倫理學爭議等優點,為傷口愈合的細胞生物治療提供了廣闊前景[6-8]。本研究采用體外培養擴增huMSCs,觀察評價皮下注射huMSCs對老齡嚙齒類動物背部壓瘡的干預效果,為臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 huMSC的培養及鑒定 取材:采用足月妊娠剖宮產健康新生兒新鮮臍帶標本(由廣州軍區總醫院產科提供),經產婦授權同意。標本采集后4 ℃保存,2 h內處理。實驗方案經醫院醫學倫理委員會批準。 胎牛血清(FBS) 購自Hyclone;小鼠抗人核單抗購自Chemicon (MAB1281),小鼠抗人線粒體單抗購自Chemicon (MAB1273)。葡萄糖、NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、多聚甲醛等均為國產分析純常規試劑。

制備流程:將長度約10 cm的臍帶在75%乙醇中漂洗后剪碎至1 mm3大小的組織塊,用 0.2%膠原酶Ⅱ消化后過濾,離心,用DMEM/F12 (+)和10%重懸細胞,按1×105cells/cm2接種細胞于T-25 cm2塑料透氣培養瓶中。3～5 d后更換培養基,去掉未貼壁細胞。以后每3 d 換液1次,至細胞融合至約80%,用2.5 g/L胰酶消化、傳代,以5×104/cm2細胞濃度傳代擴增。

活性檢驗:倒置顯微鏡觀察細胞形態;臺盼藍染色觀察計數死/活細胞數目,計算細胞活性(生存率)。

成品鑒定:流式細胞儀檢測第3 代細胞表面 CD29、CD44、CD40、CD106及CD34的表達,行細胞免疫表型鑒定;第3代細胞用多聚甲醛固定后做細胞免疫組化,確定huMSC內人核及人線粒體的表達。

1.2 壓瘡動物模型的復制及創面管理 12只22 月齡健康雌性C57BL/6J小鼠(體質量25～35 g)購自廣州軍區總醫院大學動物中心,采用磁鐵對夾皮膚壓瘡造模法,即以一對磁鐵片對夾小鼠背部皮膚12 h,連續3 d,以建立Ⅲ度壓瘡動物模型。模型成型后,壓瘡局域行皮膚外科手術十字切口并加清創膠及潰瘍貼。huMSCs組在壓瘡近圍健康組織行huMSCs皮下注射 (n=6);每個壓瘡注射6個位點。對照組同法皮下注射生理鹽水 (n=6)。

1.3 壓瘡愈合終點指標檢測

1.3.1 壓瘡面積:壓瘡初始面積 (original wound area, AO) 約等于模具面積,為5 mm2。壓瘡愈合面積(final wound area, AF)的計算采用橢圓的面積公式,即長×寬×π[9]。

1.3.2 創面愈合率 (healing rate, HR):HR的計算公式為: (AO-AF)/AO×100%[10]。

1.3.3 組織病理學的量化分析：4周后皮膚組織取材,組織石蠟包埋、切片,做常規HE染色及血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF) 免疫組化,顯微鏡下觀察,采用Dashti-Rahmatabadi 等[11]的方法并加以改良,行病理學量化分析。比對皮膚創面愈合程度(部分愈合為1分,完全愈合為2分)、炎性反應程度(炎細胞浸潤>50%為1分,炎細胞浸潤30%～50%為2分,炎細胞浸潤<30%為3分)、纖維(無纖維再生為1分,有纖維再生為2分)及肉芽組織再生情況(無肉芽組織再生為1分,有肉芽組織再生為2分)。VEGF染色程度依次分為:強陽性 (3分),陽性 (2分),弱陽性 (1分),陰性 (0分)。

2 結果

HuMSCs組治療后壓瘡創面面積顯著小于對照組 (P<0.05),HR顯著高于對照組 (P<0.05),創面病理學綜合評分顯著優于對照組 (P<0.01)。VEGF在huMSCs組均為陽性或強陽性表達,而對照組VEGF表達較弱,2組差異有統計學意義(P<0.01)。病理學綜合評分與VEGF表達密切相關 (P=0.002)。

表1 2組壓瘡創面綜合評價比較

3 討論

3.1 壓瘡高發但可控 壓瘡病人住院治療時間延長、生活質量嚴重降低、被社會孤立、情緒低沉，治療費用高，使壓瘡的預防與治療顯得尤為重要。大多數的壓瘡是可以預防的,壓瘡的發生率是臨床護理質量的評價指標之一。也正因如此,針對壓瘡的病理生理、預防及治療的研究一直都是臨床與基礎醫學研究監護的熱點。壓瘡的形成是一個長期、復雜的過程, 關于人壓瘡的活體研究還處于起步期[12], 通過以病人為主要研究對象的臨床試驗所獲得的信息仍然相當匱乏。而使用動物模型,能有效模擬臨床壓瘡的發生發展過程,可控性強,可以用于壓瘡病理生理機制及防治措施的實驗研究。

3.2 HuMSCs的優點 骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, bmMSCs) 是再生醫學的研究重點。bmMSCs主要來源于骨髓,但骨髓組織取材困難,需行骨髓穿刺術,來源受限,且隨病人年齡增長,骨髓老化可致細胞數量、質量和增殖分化能力顯著降低,并存在病毒感染的潛在危險。bmMSCs體外培養還存在老化、純化成本高、技術要求高等問題,因此限制了其臨床應用。近年研究表明,huMSCs有望成為bmMSCs的理想替代物,用于皮膚病學及再生醫學的研究[6-8, 10-15]。HuMSCs增殖分化潛能高而免疫原性低,擴增時培養體系能統一,便于質控,同時采集時對產婦及新生兒無任何危害及損傷,采集方便,易于保存和運輸。因此,huMSCs在老年病人群體具有廣闊的臨床應用前景。

3.3 HuMSCs可能通過VEGF加速皮膚壓瘡局灶愈合 本實驗中,治療組huMSCs局部注射后壓瘡瘡面干燥緊縮,病理學研究表明組織結構修復重建顯著優于對照組,可能與huMSCs移植后顯著高調組織VEGF的表達有關。VEGF又稱血管通透性因子 (vascular permeability factor, VPF) 或血管調理素 (vasculotropin),是一組功能強大且能產生多種效應的細胞因子,其生物學特性主要表現在兩方面:增加微血管通透性和特異性地與血管內皮細胞受體結合,促進血管內皮細胞的分裂和增殖,進而導致新生血管的生成。本研究中,huMSCs組壓瘡創面愈合程度高、炎性反應程度弱、肉芽組織新生活躍;創面愈合綜合評價顯著優于對照組,VEGF多為強陽性或陽性,且表達強度與創面愈合程度密切相關,提示huMSCs移植后通過促進局部缺血組織內微小側支血管重塑從而促進壓瘡修復[16-17]。

結合本文部分實驗結果,復習目前有關huMSCs移植與皮膚損傷修復重建相關研究可知,雖然huMSCs移植可促進老齡嚙齒類動物壓瘡的修復,但其臨床轉化還需要大量的動物實驗數據的支持及臨床前標準化操作規范的指導。而且,面對不同的病人和不同的壓瘡分期,如何綜合評價治療效果及甄選效果評價參數仍需進一步研究。

致謝:感謝北京軍事醫學科學院基礎醫學研究所劉少君研究員對本課題的指導。

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