冷馴化草莓組培苗DNA甲基化水平及模式的變化

苗徐靜 ，文 壯 ，文曉鵬

(1.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 農業生物工程研究院/山地植物資源保護與種質創新教育部實驗重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

草莓(Fragariaananassa)具有營養豐富、種植周期短、收益高等優點，其屬喜溫植物，最適生長溫度范圍15～30℃。但近年來全球氣溫不穩定，冬季我國多地如浙江[1]、四川[2]出現寒潮以及罕見的低溫凍害，嚴重影響了冬草莓的產量與品質[3]，給農戶帶來巨大的經濟損失，因此預防低溫給草莓生長造成的傷害，提升草莓的抗寒能力至關重要。怎樣提高冬草莓的抗寒性，已成為生產的關鍵問題之一。有研究結果表明，茶樹、椰子和草莓[4-6]等植物在通過冷馴化后抗寒性能明顯提高。植物冷馴化過程中所發生的變化是通過改變基因表達而引起的[7-8]，而植物DNA甲基化與基因表達存在關聯性，DNA發生甲基化與基因的沉默有密切關系，去甲基化則可以導致基因表達[9-10]。植物在逆境脅迫響應過程中表觀遺傳起著重要作用，其中基因組DNA甲基化則是表觀遺傳的重要形式[11-13]。甲基化敏感擴增多態性(MSAP)技術是從擴增片段長度多態性(AFLP)技術改良來的，分別采用EcoR I與MspI和HpaII組合切割植物全基因組DNA。由于MspI和HpaII是對甲基化敏感的同裂酶，因此能夠識別相同的DNA序列(CCGG)，但這兩種酶對甲基化的敏感性不同，因此最終切割后產生的片段能夠反映出DNA序列中胞嘧啶的甲基化水平和模式。此技術是當前研究DNA甲基化水平和模式的重要方法之一，現已廣泛運用于擬南芥、草莓和西瓜[14-16]等植物上。

本文擬采用MSAP技術，探究不同冷馴化時間章姬(F.ananassa‘Akihime’)草莓基因組的DNA甲基化水平及模式的變化。以期為揭示冷馴化對草莓DNA水平變化的影響及對低溫脅迫耐受性機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗選用培養室繼代10次，長勢一致的草莓栽培品種‘章姬’試管苗為試驗材料。將組培苗放入4℃人工氣候箱進行低光照(600 lx， 光照時間10 h/d)冷馴化處理，取冷馴化1 d、3 d、5 d、7 d、10 d和恢復5 d的草莓葉片，以及未進行冷馴化處理的葉片作為對照(CK)，每個處理隨機剪去15株草莓葉片混合做DNA甲基化檢測。

1.2 基因組DNA提取

對照組和處理組群體樣本的基因組DNA，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒提取?？偤怂岬鞍诇y定儀(Kaiao， K5500)和1%的瓊脂糖凝膠電泳(120 V， 30 min)檢測基因組DNA濃度和質量。DNA樣品在-20℃條件下儲存。

1.3 MSAP反應

酶切體系：用EcoR I/HpaII和EcoR I/MspI兩組酶(Fermentas)，對基因組DNA進行雙酶切。分兩次對DNA進行酶切，EcoR I酶切體系(40 μL)：4 μL 10×BufferEcoR I，1 μLEcoR I(10 U/μL)，DNA模板12 μL(約600 ng)，ddH2O補足至40 μL，混勻后37℃酶切4 h。HpaII或MspI酶切體系(20 μL)：10 μLEcoR I酶切產物，0.25 μLHpaII或MspI(10 U/μL)，2 μL 10×Buffer Tango，ddH2O補足至20 μL，混勻后37℃酶切5～8 h。取5 μL酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，以確定酶切是否完全。連接體系(30 μL)：取酶切產物20 μL，加入10 pmol/μLEcoRⅠ接頭和50 pmol/μLHpaII或MspI接頭(表1)各1 μL，0.5 μL T4 DNA Ligase(5 U/μL)，3 μL 10×Ligase buffer，ddH2O補足至30 μL，充分混勻后22℃連接5～8 h。預擴增反應體系(30 μL)：2 μL連接產物，2 μL E00預擴增引物，2 μLHM00 預擴增引物(表5)，10 μL 2× PCR MasterMix(天根生化科技有限公司)，4 μL ddH2O，混勻。程序：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，28～35個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將產物稀釋50倍用于選擇性擴增模板。選擇性擴增體系(20 μL)·3 μL預擴增稀釋產物，2 μL選擇性擴增引物EcoR I(5 μmol/L)及HpaII/MspI(5 μmol/L)(表1)，5 μL 2× PCR MasterMix，8 μL ddH2O，混合液輕輕混勻。程序：94℃預變性30 s；94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸2 min，每個循環減少0.7℃(13個循環)；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min(25～27個循環)；72℃延伸10 min；4℃保存。

加入4 μL上樣緩沖液97℃變性10 min后置于冰上，取5 μL MSAP擴增產物進行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染方法參考梁弘偉等[17]。同一酶切位點條帶的有、無分別用1、0表示，對帶型進行統計分析。

MSAP片段分為4種類型[18]。雙酶切后的PAGE膠圖上出現4種甲基化形式：I型是非甲基化位點，表示EcoR I分別與HpaII和MpsI雙酶切后都產生了條帶，即(1， 1)型。II型是半甲基化位點，表示EcoR I與HpaII酶切后產生了條帶，而EcoR I與MspI酶切后沒有產生條帶，即(1， 0)型。III型是全甲基化位點，表示EcoR I和MspI酶切后沒有產生條帶，而EcoR I和HpaII酶切后沒有產生條帶，即(0， 1)。IV是超甲基化位點，表示EcoR I分別與HpaII和MpsI雙酶切后都沒有產生條帶，即(0， 0)型。

MSAP試驗進行了3個技術重復和生物學重復。

表1 MSAP分析的接頭和引物序列Tab.1 Sequences of adapters and primers used for MSAP analysis

1.4 甲基化位點回收、克隆、測序、序列比對

在MSAP試驗完成后，切取MSAP片段(CK)，編號后放入1.5 mL的離心管內，加80～100 μL ddH2O搖晃清洗，短暫離心后吸去ddH2O，然后加入20～30 μL TE buffer，用槍頭尖端將其搗碎，置于4℃冰箱內過夜。次日取上清液3 μL作為擴增模板，用相對應的選擇性擴增引物以及選擇性擴增體系和條件進行擴增。取4 μL擴增產物，克隆到pEASY-T1載體中(pEASY-T1 Cloning Vector， 北京全式金生物技術有限公司)，25℃連接5～10 min。在1.5 mL離心管中，取2 μL連接產物轉化50 μL大腸桿菌感受態細胞(北京全式金生物技術有限公司)，加入950 μL LB液體培養基，固定在搖床上(150 r/min、37℃振蕩培養1.5～2 h)。取80～100 μL菌液涂布于含氨芐青霉素抗性的LB平板上，37℃過夜培養。挑出單克隆，加入5 mL LB液體培養基，固定在搖床上(150 r/min、37℃振蕩培養8 h)，菌液送公司測序(生工生物工程(上海)股份有限公司)，測序結果在NCBI中進行BLAST序列分析。

2 結果與分析

2.1 MSAP-PCR引物篩選

得到質量理想的DNA后，從297對選擇性擴增引物中篩選出條帶清晰、擴增結果多態性高、重復性和穩定性最好的14對引物，進行選擇性擴增展現一定的多態性(圖1)。擴增結果表明，14對引物平均每對引物擴增出25.5條譜帶(表2)。

2.2 冷馴化時間對DNA甲基化水平變化的影響

對不同冷馴化時間及恢復后的草莓葉片進行甲基化敏感擴增多態性分析(表2)。結果得出，所有樣品中擴增總數為2499個位點(圖2)，對照組與處理組從甲基化類型來看，草莓CCGG位點的甲基化主要是超甲基化(IV)，全甲基化(III)頻率高于半甲基化(II)。冷馴化過程中DNA總甲基化水平整體呈下降趨勢，0 d、1 d、3 d、5 d、7 d和10 d，基因組MSAP比率分別為27.17%、20.73%、25.77%、22.69%、22.69%和22.41%。去甲基化水平的最大值出現在低溫脅迫1 d?；謴秃?，DNA甲基化水平有所回升，說明了除去低溫脅迫后，可以發生DNA甲基化形式的恢復。

注：H：EcoR I和HpaII雙酶切產生的條帶；M：EcoR I和MspI 雙酶切產生的條帶。

圖1 MASP擴增的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測Fig.1 The result of selective PCR products detected by 6% PAGE

注：CK為對照組；1 d，3 d，5 d，7 d，10 d為低溫時間；R為恢復組?？偧谆?[( II+ III+ IV)/( I+II+ III+ IV)]×100%。全甲基化率=[( III+ IV)/( I+II+ III+ IV)]×100%。半甲基化率=[( II)/( I+II+ III+ IV)]×100%。

2.3 冷馴化時間對DNA甲基化模式的影響

基于以上試驗，不同冷馴化時間處理組、對照組與恢復組的胞嘧啶甲基化和去甲基化變化模式包括3種，共16種條帶類型(表3)。

模式一即甲基化位點無變化，此模式包含4種條帶類型(A～D)，表示在低溫處理前、后CCGG位點甲基化狀態未變化，占80.95%～88.25%，說明冷馴化前后材料大部分的CCGG甲基化位點并未改變，可以穩定遺傳。模式二即甲基化，此模式包含6種條帶類型(E～J)，表示在冷馴化前后發生甲基化位點增多，占3.08%～5.60%。模式三即去甲基化，包含6種條帶類型(K～P)，表示在冷馴化前、后發生去甲基化位點增多，占7.56%～13.73%。在低溫處理1 d、3 d、5 d、7 d、10 d后甲基化比列分別占5.60%、3.92%、3.36%、3.08%、5.32%，去甲基化比例分別占11.20%、7.56%、9.80%、12.89%、13.73%?？傮w而言，冷馴化后章姬DNA甲基化模式去甲基化高于甲基化。

注：H：EcoR I和HpaII雙酶切產生的條帶; M：EcoR I和Msp I 雙酶切產生的條帶; CK：對照組; R：恢復組：Mater為D2000。

圖2 不同冷馴化階段MASP擴增的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測
Fig.2 MSAP patterns at different cold acclimation periods

2.4 DNA 甲基化位點分析

回收、克隆及測序部分草莓(CK)基因組DNA的甲基化位點，成功分離得到5條DNA序列(表4)。經BLAST比對，在NCBI數據庫中檢索同源序列。從表4中可以看出，回收的片段比較小，最大315 bp，最小196 bp。每條序列均屬于草莓屬，包括二氫嘧啶脫氫酶[NADP(+)](b)、L-抗壞血酸氧化酶同系物(d)以及未注釋的蛋白等，表明草莓基因組中存在豐富的甲基化修飾現象，可能通過調節這些功能基因的表達來響應逆境脅迫。

高等植物基因組中“CpG” 二核苷酸是胞嘧啶殘基甲基化修飾中最主要的方式。跟據Gardiner-Garden和Frommer對“CpG island”的定義[19]，通過在線 (http：//www.ualberta.ca/～stothard/javascript/cpg_islands.html)分析，設定閾值為“CG”含量≥50%、“CpG island”長度 ≥200 bp 以及“CpG”二核苷酸實際值數/期望值≥0.60，對草莓回收得到的5條甲基化修飾DNA序列中“CpG”二核苷酸分布做分析。結果表明，雖然在這5條甲基化序列中都發現了存在明顯的“CpG”二核苷酸成簇富集現象(與MSAP結果一致)，但是只得到了1個具典型“CpG island”特征的分布區域(c)，其總長度為315 bp，“CG”含量為57.00%，“CpG”二核苷酸實際值數/期望值為0.82，“CpG island”長度為200 bp(表5) 。

表3 不同低溫處理時間下DNA甲基化模式變化Tab.3 DNA methylation pattern at different cold acclimation periods

3 結論與討論

不改變DNA序列，卻發生基因表達的可遺傳變異便是表觀遺傳變異，主要包括 DNA 甲基化修飾、非編碼RNA 調控、組蛋白修飾等[20]。DNA 甲基化修飾是表觀遺傳變異的重要方式，植物基因組的相對穩定以及響應外界環境脅迫都與DNA甲基化有密切關系[21]。不同植物甲基化水平及模式會存在差異，即使是相同的植物中不同的組織或是在不同的環境下都會存在較大的差異。在許多外界環境發生改變后，比如冷、熱、鹽害、干旱、重金屬等都會導致DNA甲基化水平及模式發生變化[11，22]。特別是在冷脅迫下，大多數情況下總甲基化水平降低，也有少部分甲基化水平升高。DNA發生甲基化與基因沉默有關，而DNA發生去甲基化則導致基因表達[23]，表明不同物種在響應外界環境脅迫時，選用不同的方式來調節自身以適應環境改變，部分物種主要發生基因沉默，而部分物種則主要發生基因表達。其原因可能是由于物種不同導致的，充分反映了物種間DNA甲基化的差異性，如玉米在冷脅迫48 h下甲基化程度降低了2.2%[24]，低溫24 d解除牡丹休眠過程中甲基化程度下降了16.8%[25]，但在茶樹冷馴化過程中變化趨勢表現為甲基化水平增加了3.5%[26]，火龍果組培苗在低溫脅迫4 d后總甲基化水平增加了1.4%[27]。本實驗結果顯示一定程度的冷馴化使草莓的甲基化程度下降了4.76%，表明在冷馴化過程中會激起草莓基因組內大量基因活躍表達。另有研究表明，棉花籽苗在低溫脅迫下導致了棉花基因組DNA甲基化水平下降，但當低溫脅迫除去后，甲基化水平可以發生一定程度的恢復[28]。在本研究中利用MSAP技術對草莓組培苗冷馴化及恢復后進行甲基化檢測，結果表明，與對照相比冷馴化后基因組DNA總甲基化水平整體呈現下降趨勢，但在恢復后DNA甲基化水平有所回升，這與上述前人的研究結果一致。由此可以看出低溫下草莓基因組調節了某些位點的甲基化水平，而且這種調節可以在低溫除去后發生逆轉。有研究表明玉米[24]在低溫脅迫至24 h和48 h后甲基化水平基本穩定在32%，本試驗也表明在低溫脅迫延長到5 d、7 d、10 d后甲基化水平基本趨于穩定(表2)，表明了DNA甲基化水平的穩定性對維持植物體生存也有著重要意義。試驗中還發現草莓在經過1 d冷馴化后，其甲基化水平達到最低，與對照組比較甲基化水平下降了6.44%，分析原因可能是植物體可以通過改變DNA甲基化來調控基因表達，以激活某些基因，從而幫助植物面對短暫的逆境環境。

在表觀遺傳水平上可以通過改變DNA甲基化模式來調節基因的表達，從而抵御非生物脅迫，來滿足植物的正常生長[29]。進一步分析發現，在甲基化模式變化方面，草莓產生了豐富的變化模式(12種)，與王小利等[30]針對高羊茅氮脅迫的試驗中高羊茅產生了11種甲基化模式的變化的結果類似。雖然草莓在低溫脅迫后基因組內存在一定數量的DNA位點發生甲基化模式變化，但超過80%的位點DNA甲基化模式與對照相比較并未發生改變，與許多前人研究結果一致[24，30]，充分表明DNA甲基化水平的穩定性對維持植物體生存有著重要意義。

有研究表明DNA甲基化是在轉錄起始階段參與調控基因的表達，從而影響植物的生長發育[31]。本試驗對部分草莓(CK)DNA甲基化位點回收，經BLAST比對后，本試驗獲得的序列與草莓屬具有較高的同源性，并且5條參考序列均為mRNA片段，獲得了二氫嘧啶脫氫[NADP(+)]、L-抗壞血酸氧化酶同系物以及未注釋的蛋白。因此可以推斷草莓基因組甲基化很可能大部分發生在編碼區域。其中抗壞血酸氧化酶廣泛存在于植物體中，與植物的生長發育、抗衰老有著密切的關系[32]。有大量研究表示抗壞血酸氧化酶能夠抵御生物或非生物脅迫[33-34]。另有研究表明小麥在病情指數增加的情況下，抗壞血酸氧化酶活性提高了23.1%以上，與增強抗病性也有密切關系[35]。本試驗結果表明在未進行冷馴化之前，抗壞血酸氧化酶基因處于甲基化狀態即沉默狀態，但在經過冷馴化之后，基因很可能被激活以抵御環境脅迫，這有待于下一步研究。

綜上，通過探究植物基因組DNA甲基化水平及模式的變化，可對植物的生長發育、抗逆性研究奠定一定基礎，可深入探究植物表觀遺傳調控的分子機理，對下一步植物育種發揮重要作用。

參 考 文 獻：

[1] 徐云煥， 蔣桂華， 楊新琴， 等.大棚草莓凍害調查與防凍減災技術措施[J].浙江農業科學， 2016， 57(8)：1190-1192.

[2] 陳 樂， 于 成.2016年冬草莓罕見低溫凍害及防御措施[J].四川農業科技， 2016(6)：34-35.

[3] 沙春艷.淺談草莓低溫障礙的發生及防止措施[J].現代園藝， 2012(5)：55-55.

[4] 楊亞軍， 鄭雷英， 王新超.冷馴化和ABA對茶樹抗寒力及其體內脯氨酸含量的影響[J].茶葉科學， 2004， 24(3)：177-182.

[5] 楊盛昌， 謝潮添， 張 平， 等.冷鍛煉對低溫脅迫下夏威夷椰子膜脂過氧化及保護酶活性的影響[J].植物資源與環境學報， 2002， 11(4)：25-28.

[6] 張 勇， 湯浩茹， 羅 婭， 等.低溫鍛煉對草莓組培苗抗寒性及抗氧化酶活性的影響[J].中國農學通報， 2008， 24(1)：325-329.

[7] Kalberer S R， Wisniewski M， Arora R.Deacclimation and reacclimation of cold-hardy plants：Current understanding and emerging concepts[J].PlantScience， 2006， 171(1)：3-16.

[8] 李 慧， 強 勝.植物冷馴化相關基因研究進展[J].植物學報， 2007， 24(2)：208-217.

[9] Vanyushin B F， Kirnos M D， DNA methylation in plants[J].Gene， 1988， 74(1)117-21.

[10] Wang W， Zhao X， Pan Y，etal.DNA methylation changes detected by methylation-sensitive amplified polymorphism in two contrasting rice genotypes under salt stress[J].GenetGenomics， 38(9)：419-420.

[11] Lukens L N， Zhan S.The plant genome's methylation status and response to stress：implications for plant improvement[J].CurrentOpinioninPlantBiology， 2007， 10(3)：317-322.

[12] Karan R， Deleon T， Biradar H，etal.Salt Stress Induced Variation in DNA Methylation Pattern and Its Influence on Gene Expression in Contrasting Rice Genotypes[J].PlosOne， 2012， 7(6)：e40203.

[13] 黃韞宇， 張海軍， 邢燕霞，等.NaCl脅迫對黃瓜種子萌發的影響及DNA甲基化的MSAP分析[J].中國農業科學， 2013， 46(8)：1646-1656.

[14] 李照令， 王鶴潼， 陳瑞娟，等.運用MSAP研究鎘脅迫對擬南芥幼苗基因甲基化的影響[J].農業環境科學學報， 2014， 33(1)：28-36.

[15] 韓柏明， 趙 愷， 李 賀，等.組織培養導致的草莓DNA甲基化變異[J].植物生理學報， 2010， 46(8)：797-802.

[16] 楊炳艷， 霍秀愛， 劉云婷，等.低溫脅迫下西瓜同源二倍體和三倍體甲基化及基因表達的差異分析[J].園藝學報， 2014， 41(11)：2313-2322.

[17] 梁宏偉， 王長忠， 李 忠，等.聚丙烯酰胺凝膠快速、高效銀染方法的建立[J].遺傳， 2008， 30(10)：1379-1382.

[18] Tang X M， Tao X， Wang Y，etal.Analysis of DNA methylation of perennial ryegrass under drought using the methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP) technique[J].MolecularGenetics&GenomicsMgg， 2014， 289(6)：1075.

[19] Gardinergarden M， Frommer M.CpG Islands in vertebrate genomes[J].JournalofMolecularBiology， 1987， 196(2)：261.

[20] 王春國， 古 瑜， 陳成彬，等.不同倍性西瓜基因組DNA甲基化水平與模式的MSAP分析[J].分子細胞生物學報， 2009， 42(2)：118-126.

[21] Kinoshita T， Miura A， Choi Y，etal.One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation[J].Science， 2004， 303(5657)：521-523.

[22] 孟華兵， 杜 雪， 姜宇曉， 等.鎘脅迫下二倍體和同源四倍體油菜DNA甲基化差異分析[J].核農學報， 2010， 24(6)：1297-1304.

[23] Xie G， Liu S， Tetsuo T，etal.Effects of salt and alkali stress ondifferential expression of genes in rice seedlings[J].ChineseJournalofApplied&EnvironmentalBiology， 2005， 11(2)：129-133.

[24] Shan X， Wang X， Yang G，etal.Analysis of the DNA methylation of maize ( Zea mays， L.) in response to cold stress based on methylation-sensitive amplified polymorphisms[J].JournalofPlantBiology， 2013， 56(1)：32-38.

[25] 蓋樹鵬， 張 風， 張玉喜，等.低溫解除牡丹休眠進程中基因組DNA甲基化敏感擴增多態性(MSAP)分析[J].農業生物技術學報， 2012， 20(3)：261-267.

[26] 周艷華， 曹紅利， 岳 川，等.冷馴化不同階段茶樹DNA甲基化模式的變化[J].作物學報， 2015， 41(7)：1047-1055.

[27] 劉鵬飛. 離體條件對火龍果DNA甲基化變異的影響[D].貴陽：貴州大學，2015.

[28] Hong H F， Wei J， Li T C，etal.DNA methylation alterations of upland cotton ( Gossypium hirsutum ) in response to cold stress[J].ActaPhysiologiaePlantarum， 2013， 35(8)：2445-2453.

[29] Yaish M W.DNA Methylation-Associated Epigenetic Changes in Stress Tolerance of Plants[M].Molecular Stress Physiology of Plants.SpringerIndia， 2013：427-440.

[30] 王小利， 王 茜， 舒健虹，等.氮脅迫下高羊茅基因組DNA甲基化的MSAP分析[J].基因組學與應用生物學， 2015， 34(11)：002362-2371.

[31] 馮素彬， 鄒枚伶， 張圣奎，等.木薯干旱脅迫下甲基化變化分析[J].分子植物育種， 2017(4)：1492-1498.

[32] 郭 燕， 朱 杰， 許自成，等.植物抗壞血酸氧化酶的研究進展[J].中國農學通報， 2008， 24(3)：196-199.

[33] Jian-Fang H U， Gui-Fen L I， Gao Z H，etal.Regulation of Water Deficit-Induced Abscisic Acid Accumulation by Apoplastic Ascorbic Acid in Maize Seedlings[J].植物學報(英文版)， 2005， 47(11)：1335-1344.

[34] 石永春， 劉衛群.植物中的抗壞血酸氧化酶[J].植物生理學報， 2008， 44(1)：151-154.

[35] 余澤高， 喬麗雅.小麥抗壞血酸氧化酶活性與抗病性關系的初步探討[J].湖北農業科學， 2003(1)：31-33.