心臟移植排斥反應中心肌細胞動作電位的變化研究

賈一新 孟旭 李巖 焦玉清 韓薇 羅文琦 王宏娟

心臟移植(HTx)是治療終末期心臟病的有效方法。排斥反應(AR)是影響HTx近遠期療效的重要因素[1-2]。早期診斷和治療AR是心臟移植患者長期存活的重要保障。利用心電生理發現和診斷排斥反應已經有較多的研究：排斥反應發生時，心室電壓減低[3-4],心肌阻抗增加[5]，靜息電位降低[6]，心肌內心電圖(intramyocardial electrograms, IMEG)QRS波幅降低，心室刺激反應的T波降支最大斜率(the maximum slope of the descending T wave of the ventricular evoked response，VER T slope)降低[7]等。這些研究揭示了排斥反應發生時，心肌細胞電生理信息的改變，但其中的機制并不清楚。動作電位(action potential，AP)的形態和時程反映了心肌細胞受到刺激后的電生理特性，間接影響其后其它電流的激活和失活過程[8-9],AP改變可以顯著地改變心肌的電生理特征，并影響心肌的功能。目前已有研究證實，在許多心血管疾病中表現出心肌細胞AP的改變。然而，在心臟移植排斥反應中，心肌細胞AP的變化并不清楚，以及其與上述排斥反應心電生理特征是否相關也鮮有研究，因此，本實驗以大鼠異位心臟移植模型為樣本，研究心臟移植物排斥反應急性期心肌細胞AP的變化。

1 資料與方法

1.1實驗動物

雄性8周齡Brown Norway(BN)大鼠共60只，體重230 g左右；雄性八周齡Lewis大鼠20只，體重230g左右。40只BN大鼠作為供體，20只BN大鼠和20只Lewis大鼠作為受體。所有動物由首都醫科大學附屬北京安貞醫院動物室提供并喂養，遵循動物福利原則，并得到倫理委員會批準。

1.2異位心臟移植

采用改良大鼠腹部心臟移植動物模型手術方法[10-11]。心臟移植物冷缺血時間小于45 min。每日經腹部觸摸檢查移植心臟存活情況。

1.3實驗分組

對照組與實驗組各20只，對照組采用同基因大鼠腹部心臟移植(BN大鼠為供、受體)，20只模型再分為4個亞組，A1、A2、B1、B2組，每組5只，A1、A2組于術后第2天處死，A1組行病理檢查，A2組行電生理實驗，B1、B2組于術后第4天處死，分別行病理學檢查和電生理實驗。實驗組采用同種異基因大鼠心臟移植(BN大鼠為供體，Lewis大鼠為受體)，20只模型同樣分為4個亞組C1、C2、D1、D2組，處理方法分別與A1、A2；B1、B2相同。

1.4病理檢查

分別于術后第2、4天，處死對應亞組大鼠，獲取移植心臟。以蘇木素-伊紅(HE)染色，參考ISHLT排斥反應分級方法，在光鏡下以半定量評分的方式評估移植心臟心肌細胞損傷和炎癥細胞浸潤情況[12-13]。ISHLT grade 0記為0分； ISHLT grade 1A記為1分； ISHLT grade 1B記為2分；ISHLT grade 2記為3分； ISHLT grade 3A記為4分； ISHLT grade 3B記為5分； ISHLT grade 4記為6分。

1.5電生理檢查

1.5.1移植物心室肌細胞制備 取出供心，離體心臟放入盛有4℃ Buffer B的10 cm小皿中，清洗心臟，迅速去除脂肪和心包膜，游離主動脈，剪開右房。打開恒流泵，主動脈逆行插管連于Langendorff灌流裝置上，心臟內血液清除干凈后改為Buffer A灌流，繼而酶液灌流。心室肌組織剪成盡量小的組織塊，用吸管輕輕吹打，使細胞從心肌碎塊上分離，獲得單個心室肌細胞。細胞復鈣完成，膜片鉗實驗中選擇桿狀，外形完整，透光度好，橫紋清晰無顆粒的細胞進行實驗研究(圖1)。

圖1 分離得到的大鼠移植心臟心室肌的細胞

1.5.2全細胞膜片鉗記錄 實驗在室溫(20～25℃)下進行，細胞孵育0.5 h后將小皿中的上清液緩慢倒出，分別加入相應的細胞外液，同時要配合使用對應的電極內液。小皿固定于倒置顯微鏡載物臺上，固定浴液電極。盡量減低噪音的干擾。顯微鏡下選取外形完整，形狀規則，邊緣整齊，表面光滑無顆粒，橫紋清晰，無收縮的長桿狀細胞。設定到電流鉗模式給予一定時間和強度的電流描記各細胞組全細胞AP的變化。設定到電壓鉗模式給予一定時間和強度的電壓刺激描記各細胞組鉀、鈉、鈣等通道電流的變化。膜片鉗放大器系統通過A/D和D/A數據轉換器與計算機進行連接，PatchMaster軟件控制相關的刺激信號以及電流、電壓信號的采集。玻璃微電極拉制儀拉制玻璃毛胚成尖端直徑1～1.5 μm的玻璃微電極。打開監測窗口，出現測試脈沖電流方波信號。充灌好電極內液的玻璃微電極正壓入水，電阻為4～5 ΜΩ，電極接觸細胞前補償液接電位。用三維操縱儀調節電極尖端的位置使其移向細胞表面，輕壓細胞微變形，1ml注射器負壓吸引封接心肌細胞，形成高阻封接(Giga seal)，封接電阻1 GΩ以上,脈沖信號消失，完成封接，進行電極電容補償。觀察1～2 min，如果不能自行破膜，1 ml注射器負壓吸引。漏電流提示失敗，退出玻璃微電極，退出前先解除微電極管內負壓狀態。若破膜成功，則會出現充放電現象，形成全細胞的記錄模式，此時要對全細胞膜電容進行補償。補償完成后給予相應的電信號刺激，進行信號采集。信號經四階貝塞爾的低通濾波器，截止頻率為1 kHz，采樣頻率為10 kHz。

1.5.3記錄方法 ①鉗制模式:將PatchMaster膜片鉗系統Recording Mode調至Whole Cell模式，封接破膜后給予相應的電壓刺激，記錄細胞的鉀、鈉和鈣離子通道電流；同樣的方法封接破膜后，將Recording Mode調至C-Clamp模式，I-membrane數值設為0，給予相應的電流刺激，記錄細胞的AP。②AP及其指標的測量：采用電流鉗方式。形成高阻封接并破膜后，給予5 ms，以100 pA階躍，自100 pA階躍至3 nA的電流刺激，頻率為20 kHz，其后以2 nA，5 ms的電刺激觀測AP電壓、AP時程(APD)、AP振幅(APA)及dV/dtMax的變化。③數據分析：本實驗獲得的原始電流數據均采用PatchMaster及Igor軟件進行分析和測量，使用GraphPad Prism 5對測量后的數據進行擬合和作圖。

1.6統計學方法

2 結果

2.1動物模型建立結果 兩組無麻醉意外，供心全部復跳，各組均有1只模型于術后第1天死于吻合口出血，對照組有1只模型于術后第1天死于腸梗阻。與對照組比較，實驗組腹主動脈阻斷時間明顯縮短(P<0.05)，見表1。

表1 兩組動物模型建立的參數及術后心率

注：括號內為實際測量心率的只數；因為BN大鼠腹主動脈與靜脈直徑較Lewis大鼠血管直徑小，因此對照組手術時間可能較實驗組略長。與對照組比較，*P<0.05

2.2病理檢查結果

對照組中的A1、B1亞組移植心臟HE染色檢查未發現明顯的炎癥細胞浸潤，無心肌細胞壞死(圖2,3)。實驗組中的C1亞組移植心臟組織學檢查可見血管周圍和間質內淋巴細胞、漿細胞浸潤，見圖4。排斥反應半定量評分1.75±0.5(n=4)。D1亞組組織學檢查看見廣泛的炎癥細胞浸潤，并可見灶性及多灶性心肌細胞壞死，見圖5。排斥反應半定量評分4.2±0.45(n=5)。

圖2 對照組中A1亞組移植心臟HE染色(左圖放大倍數40倍，右圖放大100倍)

圖3 對照組中B1亞組移植心臟HE染色(左圖放大倍數40倍，右圖放大100倍)

左圖可見心肌組織中廣泛的炎癥細胞浸潤，右圖可見血管周圍和間質內淋巴細胞漿細胞浸潤(左圖放大倍數40倍，右圖放大100倍)

可見廣泛的炎癥細胞浸潤，并可見灶性及多灶性心肌細胞壞死。(左圖放大倍數40倍，右圖放大400倍)

2.3動作電位

2.3.1APD的比較 與對照組A2亞組比較，實驗組C2亞組復極50%、90%的APD明顯縮短(P<0.05)，見表2、圖6。與對照組B2亞組比較，實驗組D2亞組復極50%、90%的APD無明顯變化(P>0.05)，見表3、圖7。

表2 A2、C2組APD的比較/ms

注：與A2組比較，*P<0.05

A2組為isogeneic group，C2組為allogeneic group

表3 B2、D2組APD的比較/ms

2.3.2APA、AP dV/dtMax的比較 對照組中，與A2亞組比較，B2亞組APA無明顯變化，而AP dV/dtMax明顯變大(P<0.05)；實驗組中，與C2亞組比較，D2亞組APA無明顯變化，而AP dV/dtMax明顯變大(P<0.05)。而A2與C2、B2與D2亞組比較，APA、AP dV/dtMax無明顯差異(P>0.05)，見表4。

B2組為isogeneic group，D2組為allogeneic group

表4 4個亞組APA、AP dV/dtMax的比較

注：與A2組比較，*P<0.05，與C2組比較，#P<0.05

3 討論

本研究中，我們首先確立了穩定的異基因大鼠心臟移植排斥反應模型，因為實驗結果除了實驗動物種屬差別的影響，所研究的排斥反應階段對實驗結果起著決定性影響[6]，只有穩定的排斥反應模型才能獲得可靠的實驗數據和結果。BN→Lewis大鼠腹部心臟移植模型病理學檢查顯示，在術后第2天、第4天，移植心臟可見廣泛的炎癥細胞浸潤，有局灶性心肌壞死，但體外觸摸心臟搏動良好，心率無明顯變化，此時的移植心臟心肌細胞可以進一步進行電生理實驗。同時我們建立了同基因大鼠心臟移植作為對照組，以去除手術、麻醉、冷缺血時間和心臟去神經化對心室肌細胞的影響。

AP是細胞處于興奮狀態的標志，本研究顯示心肌細胞APD在實驗組顯著延長，提示心肌細胞動APD的延長可能是心肌細胞電生理改變的基本電生理機制。Binah等[14]應用標準的微電極記錄技術記錄了正常大鼠心室肌組織和同基因、異基因大鼠異位心臟移植心室肌組織的APA、靜息電位和動作電位去極化最大斜率，發現異基因大鼠移植心臟心室肌AP和靜息電位幅度顯著下降，并認為APA的下降可能導致了心室肌收縮的不協調，最終影響移植心臟的收縮功能。而Babuty等[4]發現異基因大鼠心臟移植術后期左右乳頭肌APD顯著延長，APA顯著增大。二者研究結果的差異可能與動物實驗所應用的動物種屬和移植術后心臟急性排斥反應所處的階段有關。但目前尚無進一步關于移植心臟排斥反應發生時單個心肌細胞電生理的研究報道，膜片鉗技術的出現，使得我們可以測量單個離子通道開放產生的pA(10的負12次方安培)量級的電流。在我們的實驗中，對照組和實驗組大鼠腹腔心臟移植術后移植心臟都經歷了腹腔滲出、纖維層形成、間質粘連、心肌水腫等過程[15]，在進行電生理實驗中作為對照可以更準備反應排斥反應對心室肌細胞電生理的影響。全細胞膜片鉗實驗發現兩組移植心臟的APA和靜息電位無顯著差異，而實驗組大鼠移植心臟心室肌細胞的APD較對照組顯著延長。APD的延長可能導致心肌內電信號傳導異常，最終導致心肌收縮的不協調，心功能的下降[16]。因此，APD的延長可能是移植心臟早期排斥反應的最基本電生理變化，并可能導致如前所述的許多研究發現的，當移植心臟排斥反應發生時，心電生理發生的一系列異常變化[17]。

在心肌細胞AP形成過程中，多種離子電流對AP的波形形成起著重要作用。為明確AP在心臟移植排斥反應時的變化，尚需進一步的實驗研究。深入了解心肌細胞電生理變化機制，可促進心臟移植急性排斥反應的診斷和治療手段的豐富。本研究中，我們研究了排斥反應發生時，移植心臟心肌細胞的APD、APA及AP dv/dt，另外還有其他與一些離子通道影響動作電位時程，如Ca2+電流，也會影響動作電位時程，在心臟排斥反應發生時，Ca2+電流或其他離子電流是否影響動作電位的時程和形態，尚需進一步的實驗研究。

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