LncRNA-7460調控炎癥來源牙周膜干細胞成骨分化的研究

徐悅蓉 鄒宛樺 秦文 王麗穎 劉佳 金作林

人牙周膜間充質干細胞(human periodontal mesenchymal stem cells，hPDLSCs)是一種特異來源于人牙周組織的間充質干細胞，是修復牙周缺損的細胞來源［1］。但是，炎癥微環境下的 hPDLSCs(periodontal mesenchymal stem cells from periodontitis patients，PPDLSCs)的成骨分化能力明顯下降［2－3］。探索影響PPDLSCs成骨分化的因素，提高其成骨分化潛能，成為研究的方向。近年發現，長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs)可能參與骨形成調控［4］。

實驗組前期研究采用Arraystar人類LncRNA芯片(v3.0)成功的篩選出了健康微環境來源的牙周膜間充質干細胞(periodontal mesenchymal stem cells from healthy microenvironment，HPDLSCs)與 PPDLSCs中差異表達的lncRNA［5］。本實驗選取位于第7號染色體19159555～19161539，長度為 692 bp的 lncRNA7460為研究對象。在細胞水平觀察其調控能力，為改善PPDLSCs成骨分化能力，發展牙周再生治療探尋新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑和儀器

1.1.1 主要實驗試劑 胎牛血清、α-MEM 培養基(Gibco，美國);0.25%胰蛋白酶、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、I型膠原酶、茜素紅、Polybrene(Sigma，美國);Trizol Reagent Life(Technologies，美國);RNase A(Invitrogen，美國);PrimeScriptTMRT Master Mix(TAKARA No.RR036A，美國);SYBR(TAKARA No.RR820A，美國);引物(上海銳博公司);lncRNA-7460過表達、抑制慢病毒、Enhanced Infection Solution(上海吉凱基因公司);堿性磷酸酶測試劑盒(南京建成生物有限公司);堿性磷酸酶染色試劑盒(碧云天)。

1.1.2 主要實驗儀器 YJ-875型超凈工作臺(蘇州凈化設備廠);二氧化碳恒溫孵箱(Forma，美國);倒置相差顯微鏡及照相系統、倒置熒光顯微鏡(Olympus，日本);離心機(Kubota2l00，日本);紫外線分光光度儀(Eppendorf，德國);Real-time PCR(Applied Biosystems，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 選取 HPDLSCs、PPDLSCs樣本，原代培養 自10位31～41歲的健康志愿者取得HPDLSCs的牙齒樣本，PPDLSCs牙齒樣本取自28～40歲的10位慢性牙周炎志愿者，牙槽骨吸收大于根長1/2。離心收集根中1/3牙周膜組織塊，I型膠原酶37℃消化1 h。含10%胎牛血清的α-MEM于37℃、5%CO2條件孵箱培養。原代細胞培養至細胞融合達80%時，低密度傳代。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應 據Trizol試劑說明抽提細胞總RNA，控制RNA濃度在300～500 ng/μl，A260/A280為1.8 ～2.0。據試劑說明書反轉錄生成cDNA，進行qPCR檢測。qPCR反應條件:預變性:95℃，30 s，1 Cycle;PCR反應:95℃ 5 s，60℃ 20 s，40 Cycles;融解曲線分析:95℃ 0 s，65℃ 15 s，95℃ 0 s。實驗所用引物序列如表1所示。

1.2.3 lncRNA-7460過表達、抑制慢病毒轉染至細胞lncRNA-7460過表達、抑制慢病毒委托上海吉凱基因化學技術有限公司構建，根據轉染說明行PPDLSCs轉染。3 d后倒置熒光顯微鏡觀察，提取細胞RNA，RT-PCR驗證轉染效果及成骨基因表達情況。行成骨誘導，7 d后分別行RT-PCR驗證成骨基因表達情況、ALP染色及活性檢測。成骨誘導21 d行茜素紅染色及定量測定。

1.2.4 成骨分化試驗及茜素紅染色 成骨培養液:含10%胎牛血清α-MEM培養基，加 β-甘油磷酸鈉10 mmol/L、抗壞血酸 50 g/ml、地塞米松 1 × 10 mol/L。PPDLSCs成骨培養第1、7、14、21天提取細胞總RNA，21 d開始茜素紅染色;茜素紅染液:1 g茜素紅溶于100 ml蒸餾水。成骨誘導21 d PPDLSCs，多聚甲醛(4%)于室溫固定，茜素紅染液染色20 min。觀察并定量分析;茜素紅定量:六孔板每孔加入1.0 ml SDS。30 min后，吸取0.10 ml于520 nm分析吸光度。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.2.5 ALP染色以及 ALP活性測定 多聚甲醛(4%)于室溫固定成骨誘導7 d的PPDLSCs，ALP染液染色，37℃，5%CO2，30 min避光孵育后觀察;成骨誘導7 d的PPDLSCs破碎，與ALP活性測定工作液一起加入96孔板，37℃，5%CO2孵育30 min，加顯色液。酶聯免疫檢測儀520 nm檢測樣品吸光度，記錄數據。

1.3 統計學分析

數據均以珋x±s表示，用SPSS 13.0軟件(SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA)進行處理。單向方差分析法分析數據，P＜0.05表示統計學上存在顯著性差異。

2 結果

2.1 確定 lncRNA-7460為 PPDLSCs成骨分化相關lncRNA

據本研究組前期基因芯片結果，選6個PPDLSCs中表達明顯下調的lncRNA為篩選目標。qPCR檢測成骨培養7 d后各lncRNA表達變化(圖1)，發現lncRNA-7460上調10倍以上，將其作為研究目標。

圖1 PPDLSCs成骨誘導7 d lncRNAs的變化Fig 1 lncRNA expression of PPDLSCs after osteogenic differentiation for 7 d

2.2 lncRNA-7460在PPDLSCs成骨分化不同時間點的表達

實驗觀察PPDLSCs成骨誘導1～21 d的表達情況。發現lncRNA-7460的表達在成骨誘導后的1、7 d不斷升高，14、21 d的表達量雖下降，但仍高于成骨前(圖 2)。

圖2 PPDLSCs成骨誘導過程中lncRNA-7460的表達變化Fig 2 The expression of lncRNA-7460 at different time of osteogenic induction in PPDLSCs

2.3 lncRNA-7460過表達慢病毒感染PPDLSCs

轉染3 d后，熒光顯微鏡可觀察到PPDLSCs中綠色熒光染色(圖 3A)。qPCR顯示 PPDLSCs感染 lncRNA-7460過表達慢病毒后，lncRNA-7460的表達相對空病毒轉染組升高達10.08倍(圖3B)。

2.4 lncRNA-7460下調慢病毒可以成功轉染 PPDLSCs

為篩選高效lncRNA-7460下調慢病毒，構建了3個lncRNA-7460下調慢病毒，分別是58380-1、58381-1、58382-1。轉染 3 d后(圖 4A)qPCR檢測發現，58382-1抑制效率最高(圖4B)，用于后續試驗。

A:熒光顯微鏡觀察(×200);B:量化分析圖3 lncRNA-7460過表達慢病毒轉染效率A:Fluorescence microscope observation(×200);B:Quantitative analysisFig 3 The infection efficiency of lncRNA-7460-overexpressing lentiviral into PPDLSCs

2.5 lncRNA-7460可以在體外培養條件下，促進PPDLSCs的成骨分化

PPDLSCs轉染lncRNA-7460過表達慢病毒后，成骨培養7 d，qPCR檢測成骨相關基因表達情況。3個標志基因Runx2，ALP，OCN的mRNA均明顯升高(圖5A)。ALP染色和ALP活性檢測證明過表達組的ALP含量高于對照組(圖5C、5D)。成骨誘導21 d后，過表達組形成更多的鈣結節(圖5C、5E)。

相反，lncRNA-7460下調組PPDLSCs的成骨相關基因下調(圖5B);ALP表達量和鈣結節的形成量也明顯下降(圖5C～5E)。

3 討論

牙周炎是由細菌引起的牙周組織慢性感染性疾病，是導致成年人牙齒喪失的主要原因［6］。修復重建已被破壞的牙周組織的牙周再生治療依賴干細胞，生長因子以及細胞外基質支架［7］。

hPDLSCs是一種來源于牙周膜組織的間充質干細胞，特定培養條件下可向骨組織、脂肪組織、軟骨組織、神經組織等分化［1］，是再生牙周缺損最具潛力的種子細胞。但是，牙周炎癥條件引起hPDLSCs的成骨分化能力下降，是牙周再生困難的重要原因［8］。Liu等［2］首次發現，從慢性牙周炎癥組織中分離培養的PPDLSCs增殖能力增強，而成骨分化能力減弱。

A:熒光顯微鏡觀察(×200);B:量化分析圖4 lncRNA-7460抑制慢病毒轉染效率A:Fluorescence microscope observation(×200);B:Quatitative analysisFig 4 The efficiency of lncRNA-7460-knockdown lentivirus into PPDLSCs

A、B:qPCR檢測成骨相關基因;C:茜素紅、ALP染色檢測細胞成骨分化能力;D:ALP活性測定;E:茜素紅定量圖5 lncRNA-7460對PPDLSCs成骨分化的調節作用。A:Expression of osteogenic differentiation related mRNAs in PPDLSCs infected by lncRNA-7460-overexpressing lentivirus;B:Expression of osteogenic differentiation related mRNAs in PPDLSCs infected by lncRNA-7460-downregulating lentivirus;C:Osteogenic differentiation determined by Alizarin Red Sand ALPstaining;D:ALPactivity;E:Quantitative analysis of Alizarin red stainingFig 5 lncRNA-7460 promotes osteogenic differentiation of PPDLSCs

lncRNA在廣泛的生物途徑和細胞過程中發揮重要的調節作用，包括染色體失活［9］和分化［10］，干細胞多能性重編程［11］和細胞凋亡［12］。同時還參與了包括神經系統、心血管系統、炎癥和癌癥等疾病的發生發展［13－14］。許多研究認為lncRNA參與調控了干細胞成骨能力。Huang等［4］比較MSC成骨誘導分化前后的lncRNA，發現 H19可以剪切產生 miR-675，通過H19/miR-675/TGF-β1/Smad3/HDAC通路促進 MSC成骨分化。還有研究發現，lncRNA-ANCR通過抑制經典Wnt/β-catenin信號通路，抑制hPDLSCs成骨分化能力［15］。lncRNA-ANCR同樣可以在 MSC中結合EZH蛋白，抑制關鍵轉錄因子Runx2從而抑制成骨分化［16］。

本實驗組前期研究應用Arraystar人類lncRNA芯片(v3.0)，對PPDLSCs和 HPDLSCs中差異表達的lncRNA進行了分析，發現共有89個lncRNA和387個mRNA 差異表達(Change Fold ＞2，P ＜0.05)［5］。

本研究首次發現lncRNA-7460參與調控PPDLSCs成骨分化。芯片結果顯示，lncRNA-7460在HPDLSCs、PPDLSCs中均有較高的基礎表達，且在PPDLSCs明顯下調。是否是lncRNA-7460減少導致了PPDLSCs成骨能力的下降?本實驗利用qPCR檢測PPDLSCs成骨誘導前、成骨誘導1、7、14、21 d的 lncRNA-7460表達，發現成骨誘導后均發生了上調;據此推測lncRNA-7460可能與PPDLSCs成骨誘導過程相關。

該研究實驗設計構建了lncRNA-7460過表達和下調慢病毒，上調或下調lncRNA-7460的表達，并通過多種體外實驗驗證了對細胞成骨分化的影響。qPCR檢測發現，PPDLSCs在成骨誘導7 d后，成骨相關基因Runx2，ALP，OCN的mRNA表達量均較成骨誘導前有明顯升高。同時，lncRNA-7460上調組成骨相關基因表達水平較對照組上升更為明顯，而lncRNA-7460下調組的成骨相關mRNA升高不明顯。同樣，ALP染色、ALP活性測定以及茜素紅染色、定量等實驗結果也證明，lncRNA-7460上調組成骨能力增強，而下調組成骨能力減弱。本研究證實，lncRNA-7460可在體外條件下促進PPDLSCs的成骨分化過程，lncRNA-7460能否在體內環境下調節成骨分化需要進一步實驗驗證。

［1］ Seo BM，Miura M，Gronthos S，et al.Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament.［J］.Lancet，2004，364(9429):149 －155.

［2］ Liu N，Shi S，Deng M，et al.High levels ofβ-catenin signaling reduce osteogenic differentiation of stem cells in inflammatory microenvironments through inhibition of the noncanonical Wnt pathway［J］.J Bone Miner Res，2011，26(9):2082－2095.

［3］ Kong X，Liu Y，Ye R，et al.GSK3β is a checkpoint for TNF-α-mediated impaired osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in inflammatory microenvironments［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1830(11):5119－5129.

［4］ Huang Y，Zheng Y，Jia L，et al.Long Noncoding RNA H19 Promotes Osteoblast Differentiation Via TGF-β1/Smad3/HDAC Signaling Pathway by Deriving miR-675［J］.Stem Cells，2015，33(12):3481 －3492.

［5］ Wang L，Wu F，Song Y，et al.Long noncoding RNA related to periodontitis interacts with miR-182 to upregulate osteogenic differentiation in periodontal mesenchymal stem cells of periodontitis patients［J］.Cell Death Dis，2016，7(8):e2327.

［6］ Nanci A，Bosshardt DD.Structure of periodontal tissues in health and disease［J］.Periodontol 2000，2006，40:11 －28

［7］ 馮曉珂，董巖，李治治，等.骨髓間充質干細胞復合脫細胞軟骨和富血小板血漿的體內成骨實驗［J］.實用口腔醫學雜志，2017，33(2):148－151.

［8］ Zhu W，Liang M.Periodontal ligament stem cells:Current status，concerns，and future prospects［J］.Stem Cells Int，2015，2015:972313.

［9］ Lee JT，Bartolomei MS.X-inactivation，imprinting，and long noncoding RNAs in health and disease［J］.Cell，2013，152(6):1308－1323.

［10］ Guttman M，Donaghey J，Carey BW，et al.lincRNAs act in the circuitry controlling pluripotency and differentiation［J］.Nature，2011，477(7364):295－300.

［11］ Ng SY，Stanton LW.Long non-coding RNAs in stem cell pluripotency［J］.Wiley Interdiscip Rev RNA，2013，4(1):121－128.

［12］ ?rom UA，Shiekhattar R.Long noncoding RNAs usher in a new era in the biology of enhancers［J］.Cell，2013，154(6):1190－1193.

［13］ Wapinski O，Chang HY.Long noncoding RNAs and human disease［J］.Trends Cell Biol，2011，21(6):354 －361.

［14］ 蘇花，周珅玥，郭新程，等.LncRNA H19與OSF發生及癌變的關系［J］.實用口腔醫學雜志，2017，33(2):235－238.

［15］ Jia Q，Jiang W，Ni L.Down-regulated non-coding RNA(lncRNA-ANCR) promotes osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells［J］.Arch Oral Biol，2015，60(2):234－241.

［16］ Zhu L，Xu PC.Downregulated LncRNA-ANCR promotes osteoblast differentiation by targeting EZH2 and regulating Runx2 expression［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，432(4):612－617.