遠端上游元件結合蛋白1調節肝癌細胞中長鏈非編碼RNA表達的實驗研究

張波，李先鵬，許豐，姜玉華，吳益峰，陳穎

遠端上游元件結合蛋白1（FUBP1）是近期發現的一種DNA結合蛋白，通過與遠端上游元件FUSE結合調控c-myc基因轉錄表達，影響其介導的細胞生長、增殖、分化及凋亡，進而導致多種癌癥的發生、發展[1-2]。研究發現FUBP1在70%的肝癌患者中高表達，與存活率呈顯著負相關。體外研究確認FUBP1能誘導肝癌細胞增殖，可作為肝癌治療的潛在靶點[3-4]。長鏈非編碼RNA（lncRNAs）是近年來生命科學研究領域中最重要的調控因子之一，在機體發育和疾病發生發展過程中發揮著復雜而精確的調控功能[5-6]，但其具體機制尚未闡明。本研究通過lncRNA芯片技術，檢測了三種不同的肝癌細胞系中過表達FUBP1后差異表達的lncRNAs，并利用生物信息學的方法對這些lncRNA進行了功能分析?，F將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 主要試劑 肝癌細胞系（MHCC97H、MHCC97L和Huh7）為寧波市鄞州人民醫院實驗室凍存株。胎牛血清、細胞培養液、胰酶和抗生素為美國Gibco公司產品。RNA提取試劑為美國Thermo Fisher Scientific公司產品。lncRNAs芯片為Affymetrix公司產品。RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和定量PCR試劑均為日本Takara公司產品。

1.2 慢病毒感染細胞 FUBP1過表達慢病毒的構建、包裝、滴度測定由上海吉凱生物技術公司負責完成。將細胞接種于12孔細胞培養板，根據滴度將慢病毒適當稀釋后感染細胞，12 h后更換為無病毒培養液，繼續培養48 h。顯微鏡下觀察細胞生長狀態，經含puromycin抗生素的培養液篩選培養1周，并用于下一步實驗。對照組為不含FUBP1的慢病毒。

1.3 lncRNAs芯片分析 各組細胞總RNA經質檢合格后，反轉錄成雙鏈cDNA，再進一步合成cRNA，接著對cRNA進行第二輪反轉錄合成cDNA，片段化并與生物素標記后與芯片雜交，洗脫和染色后利用Affymetrix Scanner 3000掃描得到原始圖像。再經Affymetrix GeneChip Command Console軟件處理提取原始數據，利用Expression Console軟件進行genelevel和exonlevel的標準化處理。后續進行基因表達分析和共表達網絡分析。

1.4 定量PCR 以提取總RNA為模板，利用逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應，合成cDNA。反應程序為37℃，15min；85℃，5s。將適當稀釋后的cDNA作為模板，進行SYBR Green法定量PCR反應。反應程序為95℃，5 s；60℃，30 s。共40個循環。通過公式2-△△Ct分析相對表達水平。以GAPDH基因作為內參基因。

1.5 統計方法 采用SPSS23.0軟件進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差表示，采用 檢驗。＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 慢病毒感染效率的鑒定 PCR結果顯示，以對照組中 FUBP1的表達量為 1，慢病毒感染的MHCC97H、MHCC97L和 Huh7肝癌細胞株中FUBP1的mRNA水平分別為3.28±0.15、2.75±0.26和4.25±0.35，明顯高于對照組（=22.129、10.934、14.954，均＜0.01）。封三彩圖1。

2.2 過表達FUBP1后lncRNAs的表達變化 芯片結果顯示，過表達FUBP1的MHCC97H、MHCC97L和Huh7肝癌細胞株中分別有565個、1143個和755個 lncRNAs出現明顯的表達變化。合并分析顯示12個 lncRNA在3種細胞株中具有一致的表達變化，包括3個上調和9個下調，見表1。

2.3 差異表達 lncRNAs結果的驗證 隨機選擇6個一致表達變化的lncRNAs進行定量PCR驗證。結果顯示，lnc-KIAA1614-3、lnc-POU4F3-4和lnc-ARF6-3在3種細胞株均表達下調，lnc-ARF6-3的表達變化最明顯，為對照組的（26.8±5.0）%。lnc-BCAS2-1、lnc-LYZ-2和lnc-EIF2AK4-7在3種細胞株均表達上調，lnc-BCAS2-1的表達變化最明顯，為對照組的2.85±0.23倍（封三彩圖2）。

2.4 差異表達lncRNAs與mRNAs的共表達分析將差異表達的lncRNAs與mRNAs進行共表達分析，共有19個mRNAs在3種細胞株種具有一致的表達變化。結果顯示lnc-BCAS2-1、lnc-USP9X-3、lnc-LYZ-2和lnc-C14orf135-3與FUBP1具有共表達網絡（封三彩圖3）。

表1 FUBP1誘導的lncRNAs差異表達 個

3 討論

原發性肝癌是全球常見的惡性腫瘤，其中肝細胞癌是肝癌最常見的病理組織學類型，約占肝癌的90%以上[7]。目前的研究表明，肝癌的發生是個多因素多步驟的長期而復雜的過程，致癌因素和肝臟各機制之間相互作用最終導致肝癌發生，但其具體調控機制目前尚無完全闡明[8-9]。本研究以目前研究熱點之一—lncRNAs為目標，通過芯片的方法檢測了受FUBP1誘導的lncRNAs，旨在為深入理解lncRNA在肝癌發生發展中的作用及調控機制，為肝癌的診斷治療及預后提供新的方法和研究方向。

FUBP1是近期發現的一種DNA結合蛋白，通過與遠端上游元件FUSE結合調控c-myc基因轉錄表達，影響其介導的細胞生長、增殖、分化及凋亡，進而導致多種癌癥的發生、發展。從分子結構分析，FUBP1是由氨基酸末端結構域、含有4個KH基序的中央結構域及羧基末端結構域三部分構成，三個高度保守結構域是由可變的連接區域連接。其中通過KH結構域與配體位點的結合而起到對c-myc的調控作用[2,10]。肝癌細胞中過表達FUBP1引起差異表達的lncRNA可能也與c-myc的轉錄調控作用密切相關。

目前研究發現FUBP1在肝中分化及低分化細胞中均過表達，Western blot證實了肝癌組織中c-myc水平也同時升高，表明肝細胞癌形成過程中，FUBP1上調是引起c-myc表達增加的原因之一[11-12]。深入研究發現FUBP1主要誘導腫瘤細胞增殖，而FUBP2主要維持不同肝癌細胞系的擴散，且降低FUBP2水平會使FUBP1表達增加。同時肝癌組織中FUBP1的表達與stathmin的表達相關，FUBP1通過stathmin在肝細胞癌的發生、發展中發揮了一定的作用[3-4]。本研究的結果提示FUBP1對肝癌發生發展的作用也可能是由其誘導的lncRNA差異表達實現的。

IncRNAs與肝癌發生發展的研究是肝癌發病機制研究的當前熱點之一[13]。在肝癌的發生發展過程中，肝癌細胞中非編碼RNA的表達出現異常，并與癌細胞自噬密切相關[14-15]。多項研究結果說明lncRNA在肝癌的發生發展中具有重要作用[16-18]。本研究以受FUBP1誘導表達的lncRNA為方向，發現了12個在不同肝癌細胞株中具有一致表達變化的12個 lncRNAs，深入研究這些 FUBP1及這些lncRNAs對肝癌發生發展的調控作用和分子機制對肝癌的診斷和防治都具有重要的意義。

lncRNA在肝癌的發生發展中具有重要作用，但其對病理過程的調控機制目前尚未闡明。Wang等[19]發現lincGET與FUBP1形成RNA-蛋白復合物，促進長末端重復序列的順式調節活性，并通過下調FUBP1蛋白水平，抑制RNA的可變剪切。Guo等[20]研究發現lncRNA PVT1的表達水平與FUBP1、cmyc的水平明顯相關，提示其可能受到 FUBP1/cmyc的轉錄調控。Lnc-BCAS2-1基因坐落于人的1號染色體上，全長206 bp，但其作用和分子機制都尚未報道。筆者研究發現 FUBP1過表達后 lnc-BCAS2-1的表達變化最明顯，并與其有共表達網絡，提示其可能參與FUBP1調控肝癌發生的作用網絡。

綜上所述，本研究發現了不同類型的肝癌細胞株中過表達的FUBP1，利用芯片技術檢測了差異表達的 lncRNAs，篩選了可能受 FUBP1調控的lncRNAs，并分析了lncRNAs與mRNA的共表達網絡。研究結果提示FUBP1-lncRNAs的表達網絡可能與肝癌的發生、發展和轉移密切相關，深入探索其調控機制將為肝癌靶向治療研究提供新的方向。

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